Inflamación severa en nuevos

BMC Medicine volumen 20, Número de artículo: 235 (2022) Citar este artículo

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La sepsis neonatal puede inducir un deterioro cognitivo a largo plazo en la adolescencia o la edad adulta, pero el mecanismo molecular subyacente no se comprende por completo. La expresión del cotransportador 2 de K+-Cl– (KCC2) juega un papel fundamental en el cambio GABAérgico de despolarizante a hiperpolarizante durante el desarrollo posnatal temprano. En este estudio, nuestro objetivo fue determinar si el deterioro cognitivo inducido por inflamación grave neonatal se asoció con la expresión de KCC2 durante el desarrollo temprano.

La inflamación grave neonatal se estableció mediante inyección intraperitoneal de lipopolisacárido (LPS, 1 mg kg–1) en dosis altas en ratas del tercer día posnatal (P3). La tarea del laberinto de agua de Morris y la prueba de condicionamiento del miedo se utilizaron para investigar las funciones cognitivas a largo plazo. Se usaron ELISA, RT-PCR y transferencia Western para examinar los niveles de expresión de citocinas proinflamatorias y KCC2. Se usaron grabaciones perforadas de sujeción de parches para determinar el cambio GABAérgico.

La inflamación grave neonatal condujo a un deterioro cognitivo a largo plazo en ratas. Mientras tanto, se encontró una elevación sostenida de los niveles de interleucina-1 beta (IL-1β) en el hipocampo hasta P30 después de la inyección de LPS. Se observó una expresión elevada de KCC2 y potencial de inversión de GABA hiperpolarizado (EGABA) en las neuronas piramidales del hipocampo CA1 de las ratas P7-P10 y P14-P16 después de la inyección de LPS. La eliminación específica de la expresión del ARNm de IL-1β rescató la expresión elevada de KCC2 y el EGABA hiperpolarizado en P7-P10 y P14-P16. En consecuencia, la eliminación específica de la expresión de IL-1β o KCC2 mejoró el deterioro cognitivo inducido por la inflamación neonatal grave.

La elevación sostenida de IL-1β en el hipocampo puede inducir deterioro cognitivo mediante la regulación positiva de KCC2 durante el desarrollo temprano.

Informes de revisión por pares

La sepsis es un síndrome potencialmente mortal que resulta de una respuesta desregulada del huésped a las infecciones [1], particularmente en los recién nacidos. La sepsis neonatal generalmente es causada por la invasión bacteriana en el torrente sanguíneo durante el primer mes de vida [2], que es una de las principales causas de mortalidad en las unidades de cuidados intensivos neonatales [3, 4]. La Organización Mundial de la Salud estima que la sepsis neonatal causa un millón de muertes por año en todo el mundo, y el 42% de esas muertes ocurren en la primera semana después del nacimiento [5]. En los últimos años, la tasa de supervivencia de la sepsis neonatal ha mejorado notablemente con los avances médicos. Desafortunadamente, los sobrevivientes de sepsis neonatal tienen un mayor riesgo de deterioro cognitivo a largo plazo [6,7,8]. Sin embargo, el mecanismo molecular por el cual la sepsis neonatal induce deterioro cognitivo a largo plazo sigue sin estar claro.

Durante la sepsis, los niveles de expresión de citocinas proinflamatorias, como TNF, IL-6 e IL-1β, aumentan en el sistema nervioso central (SNC), que se cree que desempeña un papel fundamental en el deterioro cognitivo a largo plazo después de la sepsis. 9, 10]. La inyección sistémica de lipopolisacárido (LPS), una endotoxina bacteriana, se usa comúnmente para inducir inflamación en animales recién nacidos para reproducir las múltiples complicaciones, como el deterioro cognitivo, que también se observan en recién nacidos humanos después de la sepsis [11,12,13, 14]. La inyección de LPS puede inducir un aumento de citocinas proinflamatorias, incluidas TNF, IL-6 e IL-1β [15]. En particular, la IL-1β desempeña un papel fundamental en la neuroinflamación sostenida después de la sepsis y está estrechamente relacionada con el procesamiento de la memoria y la potenciación a largo plazo, así como con el deterioro cognitivo inducido por la sepsis neonatal [10, 16, 17]. Sin embargo, aún no está claro cómo IL-1β media el deterioro cognitivo inducido por la sepsis neonatal, particularmente durante el período de desarrollo del SNC.

El ácido γ-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibidor del SNC. Curiosamente, el GABA media los efectos despolarizantes en la etapa temprana de desarrollo de varias partes del SNC de los vertebrados debido a una alta concentración intracelular de cloruro mantenida por un importador, el cotransportador 1 de Na+-K+-2Cl– (NKCC1) [18]. Las acciones despolarizantes del GABA desempeñan un papel importante en la proliferación y supervivencia celular, la migración, la diferenciación y el cableado temprano de la red [18]. En los últimos años, la evidencia emergente brindó información sobre el papel de la señalización GABA despolarizante in vivo [18, 19], que puede depender de la región. Por ejemplo, los efectos despolarizantes de la transmisión GABAérgica median la modulación excitatoria en el hipocampo del ratón [19], mientras que provoca efectos inhibitorios [18,19,20] en el neocórtex del ratón durante el desarrollo posnatal temprano. Durante el desarrollo posnatal, se indujo un cambio de los efectos despolarizantes a los hiperpolarizantes de la activación GABAérgica por la extrusión mejorada de cloruro mediada por la regulación al alza del cotransportador 2 de K+-Cl– (KCC2) [21,22,23,24]. Este cambio GABAérgico del desarrollo puede servir como un indicador de la etapa de maduración de distintas poblaciones neuronales [25], y está asociado con el desarrollo sináptico y la plasticidad neuronal [26]. Además de establecer la polaridad de la función GABAérgica durante la maduración neuronal, KCC2 tiene funciones profundas independientes del transporte de iones, como la modulación de la apoptosis del desarrollo y las actividades tempranas de la red, y está implicada en varias enfermedades [18, 27, 28, 29].

Aunque estudios previos mostraron que la IL-1β puede regular la expresión de KCC2 en el SNC [27, 30], se desconoce si el cambio GABAérgico anormal inducido por la expresión alterada de KCC2 está involucrado en la sepsis neonatal o la inflamación severa inducida a largo plazo. deterioro cognitivo Aquí, planteamos la hipótesis de que la elevación sostenida de los niveles de IL-1β afectó el cambio GABAérgico al modular la expresión de KCC2 en las neuronas piramidales del hipocampo CA1 durante el período de desarrollo, lo que finalmente contribuyó al deterioro cognitivo a largo plazo después de la inflamación neonatal severa.

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan (Chengdu, Sichuan, China) y se llevó a cabo de acuerdo con las pautas de Investigación Animal: Reporte de Experimentos In Vivo (ARRIVE). Se compraron ratas Sprague-Dawley en el día 16 de gestación (Chengdu Dossy Experimental Animals CO., LTD.) y se separaron y monitorearon para determinar el día del nacimiento de la descendencia. Las crías posnatales (ambos sexos) se mantuvieron con sus madres con alimento y agua disponibles ad libitum. Los animales se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (7:00 a 19:00) a una humedad (45%-55%) y temperatura (22-24 °C) constantes. Después del destete en P21, los animales se alojaron en grupos de cinco ratas por jaula.

LPS (Sigma, EE. UU.) se disolvió en solución salina normal y se inyectó por vía intraperitoneal con una dosis de 1 mg kg−1 en P3. IL-1β-siRNA (secuencia sentido: 5'-GCACAGACCUGUCUUCCUATT-3'; secuencia antisentido: 5'-UAGGAAGACAGGUCUGUGCTT-3'), con la modificación de 5'-FAM, KCC2-siRNA (secuencia sentido: 5'-GCCAUUUCCAUGAGCGCAATT- 3'; secuencia antisentido: 5'-UUGCGCUCAUGGAAAUGGCTT-3') con la modificación de 5'-CY5, y control negativo (Control-siRNA, secuencia sentido: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'; secuencia antisentido: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT- 3') (GenePharma, Shanghai, China) se disolvieron en agua libre de ARNasa. Se mezcló IL-1β-siRNA, KCC2-siRNA o control negativo con el reactivo de transfección In vivo SilenceMag™ (OZ Biosciences, Marsella, Francia) hasta una concentración final de 1 μg μL−1 20 min antes de la inyección. Luego, se inyectó IL-1β-siRNA, KCC2-siRNA o control negativo en las regiones CA1 bilaterales del hipocampo (0,5 μL para cada lado) en P2 y/o P7.

Las ratas se colocaron en hielo para inducir la anestesia por hipotermia como se describe en un estudio anterior [31] y se montaron en un aparato estereotáxico (RWD, Shenzhen, China). Se aplicó pomada oftálmica a los ojos de ratas P7. Se inyectó bilateralmente IL-1β-siRNA/KCC2-siRNA/control-siRNA (0,5 μL) en las regiones CA1 del hipocampo (punto medio entre la sutura bregma y sagital, lateral: ± 1,5 mm, profundidad: 1,2–1,4 mm para P2 y 1,6 –1,8 mm para P7) a razón de 100 nL min−1. Después de completar la inyección, la pipeta de vidrio se dejó en su lugar durante 5 min y se retiró lentamente para evitar el reflujo. Luego, se permitió que los animales se recuperaran sobre una manta térmica antes de regresar a sus jaulas de origen.

Para minimizar los efectos de la camada, las crías posnatales de ambos sexos de cada camada se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales. Luego, los cachorros fueron devueltos a sus madres y destetados hasta P21. Después de P21, las ratas se reunieron en cada grupo experimental y se alojaron aleatoriamente 5 ratas por jaula (del mismo sexo). Por lo tanto, las ratas de cada jaula procedían de camadas aleatorias diferenciales. Todas las asignaciones de animales se realizaron para asegurar la distribución aproximadamente equitativa de sexo y tratamiento de cada camada. No se usaron diferentes conjuntos de camadas para las diversas cohortes de experimentos. El modelo de inflamación grave neonatal se indujo mediante la inyección intraperitoneal de una dosis alta de LPS (1 mg kg−1) en ratas P3. En el grupo de control, las ratas recibieron una inyección intraperitoneal de solución salina normal (NS) sola. En el grupo de LPS, las ratas recibieron una inyección intraperitoneal de LPS solo. En el grupo de ARNip de control NS+, las ratas recibieron una inyección de CA1 en el hipocampo de ARNip de control e inyección intraperitoneal de solución salina normal. En el grupo LPS + control-ARNip, las ratas recibieron inyección de CA1 en el hipocampo de control-ARNip e inyección intraperitoneal de LPS. En el grupo LPS + IL-1β-ARNip, las ratas recibieron una inyección CA1 hipocampal de IL-1β-ARNip e inyección intraperitoneal de LPS. En el grupo LPS + KCC2-siRNA, las ratas recibieron una inyección CA1 hipocampal de KCC2-siRNA e inyección intraperitoneal de LPS.

El aprendizaje espacial y la memoria de ratas adolescentes se evaluaron mediante la prueba del laberinto de agua de Morris, como se describió anteriormente [32]. Brevemente, el sistema consistía en una piscina redonda (90 cm de diámetro, 50 cm de profundidad) dividida en cuatro cuadrantes. Se adhirieron objetos de diferentes formas a la pared de cada cuadrante para que sirvieran como pistas visuales espaciales. La temperatura del agua se mantuvo a 30 ± 1 °C. Se colocó una plataforma circular con un diámetro de 10 cm a 1 cm por debajo de la superficie del agua negra ya 30 cm de la pared de la piscina. El cuadrante que contiene la plataforma se definió como el cuadrante objetivo. Las huellas de natación de las ratas fueron registradas por una cámara de video automática. Antes de la prueba de navegación de orientación, se entrenó a cada rata tres veces al día durante 4 días consecutivos. La rata se colocó en el agua de cara a la pared de la piscina. Si la rata encontró la plataforma dentro de los 90 s y permaneció en la plataforma durante 15 s, el período de tiempo se definió como la latencia de escape. De lo contrario, se guió a la rata a la plataforma para que permaneciera durante 15 s, y la latencia de escape se registró como 90 s. Durante la prueba, se retiró la plataforma y se permitió que la rata nadara durante 90 s. Se registró el número de cruces en el área objetivo, el tiempo empleado y la distancia total recorrida en el cuadrante objetivo, así como la velocidad media. Se utilizó el software SMART (Panlab, Barcelona, España) para analizar la traza de natación de cada rata.

Dos días después del laberinto acuático de Morris, las mismas ratas se sometieron a la prueba de condicionamiento del miedo de acuerdo con el paradigma descrito anteriormente con modificaciones menores [33]. Las ratas fueron entrenadas para conectar el contexto (cámara) con un estímulo aversivo (shock en el pie; estímulo incondicionado, EE. UU.), que puede usarse para evaluar el condicionamiento del miedo contextual dependiente del hipocampo. La descarga del pie también se combinó con una señal de tono (estímulo condicionado, CS) para evaluar el condicionamiento del miedo con señal independiente del hipocampo. El miedo condicionado se mostró como un comportamiento de congelación al cesar todo movimiento, excepto la respiración, cuando las ratas se volvieron a exponer al contexto o al tono. Los parámetros de entrenamiento fueron los siguientes: tono, 30 s, 80 dB, 2 kHz; choque, 2 s, 0,8 mA. El día 1, se colocó a cada rata en una cámara de acondicionamiento del miedo y se le permitió explorar libremente durante 2 min. Luego, se emitió un tono seguido de un golpe en el pie. Dos minutos después, se entregó un segundo par CS-US. En el día 2, cada rata se volvió a exponer a la misma cámara de acondicionamiento del miedo pero sin administración de una CS o electrochoque en las patas. La congelación se registró durante 3 min. Una hora más tarde, cada rata se colocó en un nuevo contexto que contenía un olor, una solución de limpieza, una textura del suelo y una pared de la cámara diferentes. Se permitió que las ratas exploraran durante 2 minutos antes de volver a exponerlas al tono. La congelación se evaluó durante 3 minutos y luego se midió usando el software y el sistema de seguimiento de video ANY-maze (Stoelting, Wood Dale, IL).

Las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico (100 mg kg−1) y se perfundieron transcardiacamente con solución de Ringer enfriada con hielo. El hipocampo se extrajo rápidamente y se homogeneizó con tampón de lisis helado (Beyotime, China) que contenía inhibidores de fosfatasa y proteasa. La concentración de proteínas se determinó mediante un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime, China). Veinte microgramos de muestras de proteínas se separaron con NuPAGETM4-12% Bis-Tris Gel (Thermo Fisher Scientific) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Thermo Fisher Scientific) mediante el sistema iBLOT2. La membrana se bloqueó en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 al 0,1 % y leche descremada al 5 % durante 2 h y luego se incubó con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche, incluido conejo anti-IL-1β (1:2000, Abcam ), anti-KCC2 de conejo (1:1000, Sigma-Aldrich) y anti-β-actina de conejo (1:1000, Proteintech). Luego, las membranas se incubaron con anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5000, Proteintech, China) durante 1 h a temperatura ambiente y se escanearon con reactivos de quimioluminiscencia (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) utilizando el sistema Chemidoc XRS. (Bio-Rad). La densidad de las bandas fue analizada por el software ImageJ. La densidad de las bandas del grupo de control se fijó en 100%. Los valores de densidad relativa de los otros grupos se determinaron dividiendo los valores de densidad de estos grupos por los valores de control después de normalizar cada uno a la β-actina. Las imágenes originales para los resultados de transferencia Western se mostraron en el archivo adicional 1.

El ARN total del hipocampo se aisló utilizando un kit de extracción Eastep® Super RNA (Promega, Shanghái, China) seguido de una transcripción inversa con un kit de transcripción inversa GoScript™ (Promega, Shanghái, China) según el protocolo del fabricante. Finalmente, se realizó RT-PCR con GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Shanghái, China) y cebadores específicos (Sangon Biotech, Shanghái, China). El cambio relativo en veces en la expresión génica se calculó con el método 2-ΔΔCt con GAPDH como control interno [34]. Los cebadores utilizados para detectar el ARNm de TNF, IL-6, IL-1β, KCC2 y GAPDH fueron los siguientes:

TNF directo: 5'-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT-3';

TNF inverso: 5'-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3';

IL-6 adelante: 5'-GGCCCCTTGCTTTCTCTTCG-3';

IL-6 inversa: 5'-ATAATAAAGTTTTGATTATGT-3';

IL-1β directa: 5'-AGTTGACGGACCCAAAAG-3';

IL-1β inversa: 5'-AGCTGGATGCTCTCATCAGG-3';

KCC2 adelante: 5'- AGGTGGAAGTCGTGGAGATG-3';

KCC2 inversa: 5'-CGAGTGTTGGCTGGATTCTT-3';

GAPDH adelante: 5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3';

GAPDH inversa: 5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'.

Se realizaron experimentos ELISA para cuantificar los niveles de citocinas proinflamatorias, incluidas TNF, IL-1β e IL-6, en el suero sanguíneo. Brevemente, las ratas se anestesiaron con ~ 3% de sevoflurano. Las muestras de sangre (200–500 μL) se recolectaron directamente del corazón, se conservaron en tubos con EDTA y se incubaron durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, las muestras se centrifugaron a 2000 g durante 20 min a temperatura ambiente para separar el suero de los componentes celulares de la sangre. Los sobrenadantes se extrajeron inmediatamente y se congelaron en nitrógeno líquido. Se utilizaron kits ELISA (Neobioscience) para determinar los niveles de citoquinas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia a 450 nm se midió con un lector de microplacas Tecan Sunrise™ con corrección de longitud de onda a 680 nm conectado al software Magellan. La concentración de proteína de las muestras se determinó por la densidad óptica medida de la reacción de acuerdo con la densidad óptica de las muestras estándar conocidas.

Se anestesiaron ratas en P7-P10, P14-P16 o P28-P32 de ambos sexos con pentobarbital sódico (100 mg kg−1). El cerebro se diseccionó rápidamente y se obtuvieron cortes transversales del hipocampo dorsal (300 μm de espesor) en líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa enfriado con hielo que contenía (en mM): 260 sacarosa, 26 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 CaCl2, 5 MgCl2 y 10 glucosa usando un vibratomo (VT1000 A; Leica). Los cortes se transfirieron inmediatamente y se incubaron a 35 °C con líquido cefalorraquídeo artificial que contenía (en mM): 130 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3 y 10 glucosa durante 45 min y luego se mantuvieron a temperatura ambiente. temperatura (24–26 °C) durante 30 min antes de la grabación. La solución de corte e incubación se burbujeó continuamente con O2 al 95 %/CO2 al 5 %, con un pH de 7,35.

Los cortes de hipocampo se montaron en una cámara de registro y se perfundieron con líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) a una velocidad de flujo de 2 ~ 3 ml min−1 y se burbujearon con O2 al 95 % y CO2 al 5 %, pH = 7,35. Las células piramidales de CA1 se probaron secuencialmente comenzando cerca del borde de CA2/CA1 y procediendo medialmente en ubicaciones bien separadas. A continuación, las neuronas piramidales se identificaron bajo contraste diferencial/iluminación infrarroja por su ubicación en la capa del cuerpo celular y por su forma piramidal. Los registros perforados se realizaron utilizando pipetas de parche (6–8 MΩ) llenas con la solución interna que contenía (en mM) 140 K-gluconato, 10 HEPES, 5 EGTA 1 MgCl2, 2 Na2-ATP, 0,3 Na2-GTP, pH ajustado a 7,2 con KOH y osmolaridad a ~ 285 mOsm. Las pipetas de parche se llenaron mínimamente por delante con la solución interna estándar y luego se volvieron a llenar con una solución que contenía gramicidina. La gramicidina (HY-P0163, MedChemExpress), disuelta en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración final de 50 μg mL-1, se utilizó como agente formador de poros para registros perforados. Los canales de gramicidina son selectivamente permeables a cationes monovalentes y moléculas neutras pequeñas, pero impermeables al cloruro, lo que permite el acceso eléctrico a las neuronas registradas sin alterar sus gradientes aniónicos. Dentro de ~ 20 a 40 minutos después de la formación del sello giga, la resistencia de acceso disminuyó lentamente y se estabilizó en ~ 20 a 35 MΩ. Luego se registró el potencial de membrana en reposo (RMP) como el voltaje sin corriente inyectada. Para estimar la concentración de cloruro se evaluó el potencial de inversión de GABA (EGABA). Las neuronas se mantuvieron a –60 mV y el potencial de membrana se escalonó a varios potenciales de prueba de –80 a –30 mV. Durante cada paso de potencial de membrana, se suministró GABA (10 μM) en solución extracelular mediante aplicación de baño para activar corrientes en presencia de cianquixalina (CNQX, 10 μM) y ácido DL-2-amino-5-fosfonopentanoico (40 μM). Se calculó una regresión lineal entre la amplitud de las corrientes inducidas por GABA frente al potencial de membrana, y la intersección de esta línea con la abscisa se tomó como EGABA. Todos los registros electrofisiológicos se realizaron utilizando un amplificador Axopatch 700B y un digitalizador Digidata1440 conectado a una computadora con el software pClamp 10.2 (Molecular Devices, Sunnyvale, EE. UU.). Las señales se muestrearon a 20 kHz y se filtraron a 10 kHz. Las capacitancias de las celdas y los electrodos se compensaron electrónicamente durante el registro. La celda se descartó si la resistencia de acceso cambió en > 25%.

Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar (SD), y los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, CA, EE. UU.). La normalidad de la distribución de datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Se utilizaron las pruebas t de Student pareadas/no pareadas o las pruebas U de Mann-Whitney para comparar los datos de distribución paramétrica o los datos de distribución no paramétrica entre dos grupos, respectivamente. Los datos de tres o más grupos se analizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una o dos vías con medidas repetidas seguidas de una prueba post hoc de Bonferroni o Tukey. El análisis exacto utilizado para cada comparación se describió en las leyendas de las figuras, y toda la información estadística para cada resultado se resumió en el Archivo adicional 2: Tabla S1-S11. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Se indujo un modelo de inflamación neonatal en ratas P3 (Fig. 1A). En comparación con el grupo de control, la ganancia de peso corporal de las ratas fue más lenta durante el desarrollo en el grupo LPS (Fig. 1B, n = 8, ** P < 0,01, *** P < 0,001 frente al grupo de control). No se encontró muerte en las ratas del grupo control, mientras que en el grupo LPS se observó una mortalidad del 36,7% (Fig. 1C, ** P < 0,01). El entrenamiento en la tarea del laberinto acuático de Morris (MWM) se realizó desde P28 hasta P31. Durante los 4 días de entrenamiento de adquisición, la latencia de escape disminuyó gradualmente en las ratas de los grupos de control y LPS, lo que sugiere que ambos grupos mostraron formación de memoria y aprendizaje espacial dependiente del hipocampo (Fig. 1D). Sin embargo, la latencia de escape en las ratas del grupo LPS aumentó significativamente en comparación con las ratas de control en el día 4 de entrenamiento, lo que indica un posible deterioro en la formación de la memoria (Fig. 1D, n = 15-19, P = 0,029). Durante la prueba de sonda espacial (Fig. 1E), el tiempo empleado (Fig. 1F, n= 15–19, *** P < 0,001) y la distancia (Fig. 1G, n= 15–19, *** P < 0,001) en el cuadrante objetivo, así como los tiempos de cruce de la plataforma (Fig. 1H, n= 15–19, *** P < 0,001), se redujeron en el grupo LPS en comparación con el grupo control. No se encontraron diferencias significativas en la velocidad media de las ratas entre los dos grupos (Fig. 1I, n = 15–19, P = 0,065), lo que sugiere que la inyección de LPS no afectó la capacidad locomotora. Luego, las mismas ratas se sometieron a una prueba de condicionamiento del miedo (FC) (Fig. 1J). Después del entrenamiento en P34 (Fig. 1K), las ratas en el grupo LPS exhibieron una disminución de la congelación en las pruebas contextuales dependientes del hipocampo en comparación con las del grupo de control (Fig. 1L, n = 15–19, *** P < 0.001), pero no se observaron diferencias para la prueba de tono de señal independiente del hipocampo en P35 (Fig. 1M, n = 15–19, P = 0.474).

La inflamación grave neonatal conduce a un deterioro cognitivo duradero en ratas adolescentes. (A) Esquema que ilustra el orden cronológico utilizado para el establecimiento del modelo de inflamación y las pruebas cognitivas. Se utilizaron cinco camadas en esta cohorte de experimento. (B) El desarrollo del peso corporal en ratas (n = 8). (C) La curva de supervivencia de las ratas. (D) Curva de aprendizaje para la latencia de escape. (E) Rastros representativos para la prueba MWM. (F) El tiempo pasado en el cuadrante objetivo (n = 15-19). (G) Distancia gastada en el cuadrante objetivo (n = 15-19). (H) Número de cruces de plataforma (n = 15-19). (I) Velocidad media durante la prueba de sonda espacial (n = 15–19). (J) El protocolo experimental para FC. (K) El tiempo de congelación de ratas durante el entrenamiento FC. (L) El tiempo de congelación de las ratas en el contexto de la prueba FC (n = 15-19). (M) El tiempo de congelación de las ratas en la prueba FC con claves (n = 15–19). LPS: lipopolisacárido; NS: solución salina normal; MWM: laberinto de agua de Morris; FC: condicionamiento del miedo; Los paneles B, D y K se compararon mediante ANOVA de dos vías con medidas repetidas seguidas de una prueba post hoc de Bonferroni; El panel C se comparó mediante la prueba de rangos logarítmicos; Los paneles F, G, H, I, L y M se compararon mediante la prueba t de Student de dos colas para datos no apareados; * P < 0,05, ** P < 0,01 y *** P < 0,001, ns: sin significación; Las barras de error indican SD

Es de destacar que se realizó un análisis adicional durante la revisión por pares para determinar si el deterioro cognitivo inducido por la inflamación grave neonatal dependía del sexo. No se encontraron diferencias de sexo significativas en la prueba MWM, ya que las ratas sépticas macho y hembra exhibieron una disminución similar en el tiempo empleado (Archivo adicional 3: Fig. S1A izquierda, n = 9, ** P < 0.01 para machos; Archivo adicional 3: Fig. . S1A derecha, n = 6–10, ** P < 0,01 para mujer) y la distancia (Archivo adicional 3: Fig. S1B izquierda, n = 9, ** P < 0,01 para hombre; Archivo adicional 3: Fig. S1B derecha, n = 6–10, P = 0,046 para mujeres) en el cuadrante objetivo, así como los tiempos de cruce de la plataforma (Archivo adicional 3: Fig. S1C izquierda, n = 9, *** P < 0,001 para hombres; Archivo adicional 3: Fig. S1C derecha, n = 6–10, *** P < 0,001 para hembra) en comparación con las ratas de control. De manera similar, en comparación con el grupo de control, una disminución de la congelación en las pruebas contextuales (Archivo adicional 3: Fig. S1D izquierda, n = 9, *** P < 0,001 para hombres; Archivo adicional 3: Fig. S1D derecha, n = 6–10 , *** P < 0,001 para mujeres) y ninguna diferencia en la prueba de tono de señal (Archivo adicional 3: Fig. S1E izquierda, n = 9, P = 0,301 para hombres; Archivo adicional 3: Fig. S1E derecha, n = 6 –10, P = 0,949 para hembra) en ambos sexos de ratas que recibieron LPS. Estos resultados sugieren que la inflamación neonatal severa puede inducir deterioros cognitivos a largo plazo en ambos sexos.

Los niveles de citocinas proinflamatorias en sangre periférica se examinaron mediante ELISA en diferentes momentos después de la inyección de LPS (Fig. 2A). Los resultados mostraron que TNF (Fig. 2B, n= 6, ** P < 0.01), IL-6 (Fig. 2D, n= 6, ** P < 0.01, *** P < 0.001) e IL-1β (Fig. 2F, n = 6, ** P < 0,01, *** P < 0,001) en suero de sangre periférica aumentaron significativamente a las 2 h, 4 h y 6 h después de la inyección de LPS, pero todos regresaron a los niveles de control en 24 h después de la inyección de LPS (Fig. 2B, 2D, 2F, n = 6, P> 0,05). Luego, examinamos los niveles de expresión de estas citocinas proinflamatorias en el hipocampo mediante RT-PCR y transferencia Western. En comparación con las ratas de control, los niveles de expresión de ARNm de TNF (Fig. 2C, n= 6, ** P < 0,01) e IL-6 (Fig. 2E, n= 6, ** P < 0,01) estaban marcadamente elevados en el hipocampo a las 6 h después de la inyección de LPS, pero ambos regresaron a los niveles de control en P5 (Fig. 2C, 2E, n = 6, P> 0.05). En particular, los niveles elevados de ARNm de IL-1β (Fig. 2G, n = 6, ** P < 0.01) y proteína (Archivo adicional 3: Fig. S2, n = 6, ** P < 0.01, *** P < 0,001) se mantuvieron al menos hasta P30, lo que sugiere que la IL-1β era la citoquina proinflamatoria predominante en el SNC después de una inflamación neonatal grave.

La inflamación grave neonatal induce una elevación sostenida de IL-1β en el hipocampo de rata. (A) Esquema que ilustra el orden cronológico utilizado para la prueba de citoquinas proinflamatorias después de la inflamación neonatal. Se utilizaron catorce camadas en esta cohorte de experimento. (B, D, F) Resultados de ELISA que muestran los niveles de proteína de TNF (B), IL-6 (D) e IL-1β (F) en suero de sangre periférica a las 2 h (n = 6), 4 h (n = 6), 6 h (n = 6) y 24 h (n = 6). (C, E, G) Resultados de PCR que muestran los niveles de ARNm de TNF hipocampal (C) e IL-6 (E) a las 6 h después de la inyección de LPS (n = 6), P5 (n = 6), P7 (n = 6 ), y P14 (n = 6), e IL-1β después de la inyección de LPS (G) a las 6 h (n = 6), P5 (n = 6), P7 (n = 6), P14 (n = 6), y P30 (n = 6). LPS: lipopolisacárido, NS: solución salina normal, los paneles B, C, D, E, F y G se compararon mediante la prueba t de Student de dos colas para datos no apareados o la prueba U de Mann-Whitney; ** P < 0,01 y *** P < 0,001, ns: sin significación; Las barras de error indican SD

Para determinar el papel del aumento sostenido en los niveles de IL-1β en el deterioro cognitivo inducido por la inflamación neonatal, se inyectó bilateralmente IL-1β-ARNip en la región CA1 del hipocampo para eliminar la expresión de ARNm de IL-1β (Fig. 3A) . La fluorescencia transportada por IL-1β-siRNA se detectó en CA1 (archivo adicional 3: Fig. S3A). Los niveles de ARNm de IL-1β disminuyeron significativamente por IL-1β-ARNip dos días después de la inyección (Fig. 3B, n= 6, *** P < 0,001). En comparación con el grupo LPS + control-siRNA, la latencia de escape en ratas del grupo NS + control-siRNA (Fig. 3C, *** P < 0,001) y LPS + IL-1β-siRNA (Fig. 3C, ** P <0,01) los grupos se redujeron significativamente en el día de entrenamiento 4 de MWM. Para la prueba MWM, el tratamiento con IL-1β-siRNA mejoró significativamente el deterioro cognitivo inducido por inflamación neonatal (Fig. 3D-3F, n= 15–24, *P = 0,012, ** P < 0,01, *** P < 0,001) . No se encontraron diferencias significativas en la velocidad media de las ratas entre los tres grupos (Fig. 3G, n = 15–24, P = 0,611). Para FC, después del entrenamiento (Fig. 3H), las ratas en el grupo LPS + IL-1β-siRNA exhibieron una mayor congelación en las pruebas contextuales dependientes del hipocampo en comparación con las del grupo LPS + control-siRNA (Fig. 3I, n = 15 –24, ** P < 0,01, *** P < 0,001). No se observaron diferencias para las pruebas de tono de señal independientes del hipocampo entre estos tres grupos (Fig. 3J, n = 15–24, P = 0.786). Estos hallazgos indican que los niveles elevados sostenidos de IL-1β contribuyen al deterioro cognitivo a largo plazo después de la inflamación neonatal.

La elevación sostenida de los niveles de IL-1β en el hipocampo contribuye al deterioro cognitivo a largo plazo después de una inflamación neonatal grave. (A) Esquema que ilustra el orden cronológico utilizado para la entrega de siRNA, la administración de LPS y las pruebas cognitivas. Se usaron ocho camadas en esta cohorte de experimento. (B) Resultados de PCR que muestran la eficiencia de eliminación de IL-1β-siRNA (n = 6). (C) Curva de aprendizaje para la latencia de escape. (D) Tiempo pasado en el cuadrante objetivo (n = 15-24). (E) Distancia gastada en el cuadrante objetivo (n = 15–24). (F) Número de cruces de plataforma (n = 15–24). (G) Velocidad media durante la prueba de sonda espacial (n = 15-24). (H) El tiempo de congelación de ratas en entrenamiento FC. (I) El tiempo de congelación de las ratas en el contexto de la prueba FC (n = 15–24). (J) El tiempo de congelación de las ratas en la prueba FC con claves (n = 15–24). LPS: lipopolisacárido; NS: solución salina normal; MWM: laberinto de agua de Morris; FC: condicionamiento del miedo; El panel B se comparó mediante la prueba t de Student de dos colas para datos no apareados; Los paneles C y H se compararon mediante ANOVA de dos vías con medidas repetidas seguidas de una prueba post hoc de Bonferroni; Los paneles D, E, F, G, I y J se compararon mediante ANOVA unidireccional con medidas repetidas seguidas de una prueba post hoc de Tukey; ** P < 0,01 y *** P < 0,001, ns: sin significación; Las barras de error indican SD

En primer lugar, determinamos si la expresión de KCC2 era específica del sexo durante el desarrollo en ratas. Los niveles de expresión de KCC2 aumentaron gradualmente en el hipocampo de P3 a P14. Los niveles de expresión de KCC2 (Archivo adicional 3: Fig. S4A, n = 6, P > 0,05; Archivo adicional 3: Fig. S4B, n = 4, P > 0,05) no mostraron diferencias de sexo entre P3 y P14. Luego, encontramos que la inyección de LPS en P3 indujo una mayor expresión de KCC2 en P7 (panel izquierdo de la Fig. 4B, n = 6, *** P < 0,001) y P14 (panel central de la Fig. 4B, n = 6, ** * P < 0,001) en comparación con el control normal. No se encontraron diferencias en la expresión de KCC2 (Fig. 4B panel derecho, n = 6, P> 0.05) en ratas en P30 entre el grupo LPS y el grupo de control. Estos resultados indican que la inflamación neonatal puede acelerar el aumento del nivel de expresión de KCC2 durante el desarrollo temprano.

KCC2 media los efectos de IL-1β en el deterioro cognitivo inducido por inflamación grave neonatal. (A) Esquema que ilustra el orden cronológico utilizado para establecer el modelo de inflamación y las pruebas de nivel de KCC2. Se utilizaron cinco camadas en esta cohorte de experimento. (B) Los niveles de proteína de KCC2 en ratas P7 (panel izquierdo, n = 6), P14 (panel central, n = 6) y P30 (panel derecho, n = 6) después de la inyección de LPS. (C) Esquema que ilustra el orden cronológico utilizado para la inyección de siRNA, el establecimiento del modelo de inflamación y las pruebas cognitivas. Se usaron nueve camadas en esta cohorte de experimento. (D) La eficiencia de eliminación de KCC2-siRNA por PCR (n = 6). (E) Curva de aprendizaje para la latencia de escape. (F) Tiempo pasado en el cuadrante objetivo (n = 10-15). (G) Distancia gastada en el cuadrante objetivo (n = 10-15). (H) Número de cruces de plataforma (n = 10-15). (I) Velocidad media durante la prueba de sonda espacial (n = 10–15). (J) El tiempo de congelación de las ratas durante el entrenamiento FC. (K) El tiempo de congelación de las ratas en el contexto de la prueba FC (n = 10-15). (L) El tiempo de congelación de las ratas en la prueba FC con claves (n = 10–15). LPS: lipopolisacárido; NS: solución salina normal; MWM: laberinto de agua de Morris; FC: condicionamiento del miedo; Los paneles B y D se compararon mediante la prueba t de Student de dos colas para datos no apareados; Los paneles F, G, H, I, K y L se compararon mediante ANOVA unidireccional con medidas repetidas seguidas de una prueba post hoc de Tukey; * P < 0,05, ** P < 0,01 y *** P < 0,001, ns: sin significación; Las barras de error indican SD

Se usó KCC2-siRNA para disminuir la expresión de KCC2 en CA1 del hipocampo. La fluorescencia transportada por KCC2-siRNA se detectó en CA1 (archivo adicional 3: Fig. S3B). La eficiencia de eliminación de KCC2-siRNA se confirmó mediante RT-PCR (Fig. 4D, n = 6, *** P <0.001). La inyección de IL-1β-ARNip disminuyó la expresión de IL-1β en el hipocampo en P7 (Archivo adicional 3: Fig. S5A panel izquierdo, n = 6–8, *** P < 0,001; Archivo adicional 3: Fig. S6 izquierda panel, n = 6, *** P < 0.001), P14 (Archivo adicional 3: Fig. S5A panel central, n = 6, ** P < 0.01; Archivo adicional 3: Fig. S6 panel central, n = 6, ** P < 0,01) y P30 (Archivo adicional 3: Fig. S5A panel derecho, n = 6, * P = 0,037; Archivo adicional 3: Fig. S6 panel derecho, n = 6, * P = 0,013) después de la inyección de LPS en P3. La inyección de ARNip de KCC2 disminuyó la expresión de KCC2 en el hipocampo en P7 (archivo adicional 3: panel izquierdo de la Fig. S5B, n = 6, * P = 0,025; archivo adicional 3: panel izquierdo de la Fig. S7, n = 6, * P = 0,024) y P14 (Archivo adicional 3: Fig. S5B panel central, n = 6, ** P < 0,01; Archivo adicional 3: Fig. S7 panel central, n = 6, * P = 0,014) después de la inyección de LPS en P3 . Además, la eliminación de la expresión de IL-1β inhibió el aumento de la expresión de KCC2 (Archivo adicional 3: Fig. S5B panel izquierdo y central, n = 6, * P = 0,044 para P7, * P = 0,038 para P14; Archivo adicional 3: Fig. Panel medio S7, n = 6, * P = 0,037 para P14) inducido por inyección de LPS. En consecuencia, el deterioro cognitivo inducido por la inflamación neonatal severa mejoró significativamente con la inyección de IL-1β-siRNA y/o KCC2-siRNA (Fig. 4F-4H, 4K, n= 10–15, * P < 0.05, ** P < 0,01, *** P < 0,001), lo que indica que la inhibición de la elevación de la expresión de IL-1β y/o KCC2 durante el período de desarrollo GABAérgico fue capaz de prevenir el deterioro cognitivo a largo plazo inducido por la inflamación neonatal grave.

A continuación, abordamos los efectos de la inflamación neonatal sobre las propiedades electrofisiológicas intrínsecas de las neuronas piramidales CA1 de ratas en P7-P10, P14-P16 y P28-P32 (Fig. 5A). Se determinó el potencial de reversión de GABA (EGABA) para probar directamente los cambios en la homeostasis del cloruro de los cortes de CA1 después de una inflamación neonatal grave. La inflamación neonatal causó un cambio hiperpolarizante significativo en EGABA tanto en P7-P10 (Fig. 5B-5D, n = 10–12 células de 4–5 ratas, *** P < 0.001) como en P14-P16 (Fig. 5F-5H). , n= 7 células de 3–4 ratas, ** P < 0,01), acompañadas de un potencial de membrana en reposo hiperpolarizado (RMP) (Fig. 5E, n= 9–14 células de 5–6 ratas, ** P < 0,01 Fig. 5I, n = 10–13 células de 4–5 ratas, ** P <0.01). La eliminación de la expresión de IL-1β o la expresión de KCC2 alivió el cambio hiperpolarizante inducido por inflamación neonatal en EGABA (Fig. 5M-5O, n = 7–8 células de 3–4 ratas, * P = 0.02 vs. LPS + IL-1β- grupo siRNA, * P = 0,033 frente a LPS + grupo KCC2-siRNA, Fig. 5Q-5R, n = 5–7 células de 3–4 ratas, * P = 0,02, ** P < 0,01) y RMP hiperpolarizado (Fig. 5P, n= 7–11 células de 4–5 ratas, * P = 0,025 frente al grupo LPS + IL-1β-siRNA, * P = 0,023 frente al grupo LPS + KCC2-siRNA Fig. 5S, n= 7 –9 células de 3–4 ratas, * P = 0,022 frente al grupo LPS + IL-1β-siRNA, * P = 0,011 frente al grupo LPS + KCC2-siRNA) tanto en P7-P10 como en P14-P16. No se encontraron diferencias significativas en EGABA (Fig. 5J-5K, n= 6–7 células de 3–4 ratas, P > 0,05) o RMP (Fig. 5L, n= 8–10 células de 4–5 ratas) , P > 0,05) en ratas P28-P32 entre los grupos LPS y control.

EGABA se hiperpolariza en las neuronas piramidales CA1 de ratas después de una inflamación neonatal grave. (A) Esquema que ilustra el orden cronológico utilizado para la entrega de siRNA, la administración de LPS y las grabaciones de parches perforados. Se utilizaron quince camadas en esta cohorte de experimento. (B) Rastros representativos de corrientes inducidas por GABA al potencial de retención de -80 a -30 mV en incrementos de 10 mV de neuronas del hipocampo en P7-P10. (C) Curva de corriente-voltaje (IV) de corrientes inducidas por GABA registradas a diferentes potenciales de mantenimiento de -80 a -30 mV en incrementos de 10 mV de neuronas piramidales en P7-P10. (D) Valores de EGABA por célula obtenidos de todas las curvas IV que indican un cambio hiperpolarizante en ratas sépticas en P7-P10 (n = 10–12 células de 4–5 ratas). (E) Valores de RMP que muestran un cambio hiperpolarizante en ratas sépticas en P7-10 (n = 9–14 células de 5–6 ratas). (F) Rastros representativos de corrientes inducidas por GABA al potencial de retención de -80 a -30 mV en incrementos de 10 mV de neuronas del hipocampo en P14-P16. (G) Curva de corriente-voltaje (IV) de corrientes inducidas por GABA registradas a diferentes potenciales de mantenimiento de -80 a -30 mV en incrementos de 10 mV de neuronas piramidales en P14. (H) Valores de EGABA por célula obtenidos de todas las curvas IV que indican un cambio hiperpolarizante en ratas sépticas en P14-P16 (n = 7 células de 3 a 4 ratas). (I) Valores de RMP que muestran un cambio hiperpolarizante en ratas sépticas en P14-P16 (n = 10–13 células de 4–5 ratas). (J) Curva de corriente-voltaje (IV) de corrientes espontáneas inducidas por GABA registradas a diferentes potenciales de mantenimiento de − 80 a − 30 mV en incrementos de 10 mV de neuronas piramidales en P28-P32. (K) Valores de EGABA por célula obtenidos de todas las curvas IV que indican un cambio hiperpolarizante en ratas sépticas en P28-32 (n = 6–7 células de 3–4 ratas). (L) Valores de RMP que muestran un cambio hiperpolarizante en ratas sépticas en P28-P32 (n = 8–10 células de 4–5 ratas). (M) Rastros representativos de corrientes inducidas por GABA al potencial de retención de -80 a -30 mV en incrementos de 10 mV de neuronas del hipocampo en P7-P10 después de la inyección de siRNA. (N) Curva de corriente-voltaje (IV) de las corrientes inducidas por GABA registradas a diferentes potenciales de mantenimiento de − 80 a − 30 mV en incrementos de 10 mV de neuronas piramidales en P7-P10 después de la inyección de siRNA. (O) Valores de EGABA por célula obtenidos de todas las curvas IV en P7-P10 después de la inyección de siRNA (n = 7–8 células de 3–4 ratas). (P) Valores de RMP en P7-P10 después de la inyección de siRNA (n = 7–11 células de 4–5 ratas). (Q) Curva de corriente-voltaje (IV) de las corrientes inducidas por GABA registradas a diferentes potenciales de mantenimiento de − 80 a − 30 mV en incrementos de 10 mV de neuronas piramidales en P14-P16 después de la inyección de siRNA. (R) Valores de EGABA por célula obtenidos de todas las curvas IV en P14-P16 después de la inyección de siRNA (n = 5–7 células de 3–4 ratas). ( S ) Valores de RMP en P14-P16 después de la inyección de siRNA (n = 7–9 células de 3–4 ratas). LPS: lipopolisacárido; NS: solución salina normal; EGABA: potencial de reversión de GABA; Los paneles D, E, H, I, K y L se compararon mediante la prueba t de Student de dos colas para datos no apareados; Los paneles O, P, R y S se compararon mediante ANOVA unidireccional con medidas repetidas seguidas de una prueba post hoc de Tukey; * P < 0,05, ** P < 0,01 y *** P < 0,001, ns: sin significación; Las barras de error indican SD

El presente estudio revela que la inflamación grave neonatal puede inducir un deterioro cognitivo duradero en ratas adolescentes a través de la regulación positiva de la señalización de IL-1β/KCC2 durante el desarrollo neonatal, acompañada de un cambio GABAérgico acelerado de despolarizante a hiperpolarizante.

En general, se reconoce que la inflamación del SNC desempeña un papel fundamental en el desarrollo de un deterioro cognitivo duradero después de una inflamación temprana en la vida [35, 36]. Las citoquinas proinflamatorias, particularmente la IL-1β, juegan un papel importante en el proceso de inflamación del SNC después de la inflamación neonatal [16, 17]. Además, se sabe que la IL-1β influye en la memoria y el aprendizaje dependientes del hipocampo [37]. De acuerdo con la evidencia previa [10], nuestros resultados mostraron que la IL-1β, pero no la IL-6 y el TNF, se mantuvo en un nivel alto al menos hasta el día 30 posnatal después de la inyección de LPS en P3. En particular, la eliminación de la expresión de IL-1β alivió significativamente el deterioro cognitivo de larga duración inducido por la inflamación neonatal, lo que confirma el papel importante de los niveles elevados sostenidos de IL-1β en este trastorno.

GABA despolariza las neuronas inmaduras durante los primeros días posnatales [38, 39]. Durante la maduración neuronal, hay un cambio funcional mediado por GABA de despolarizante a hiperpolarizante por regulación positiva del exportador de cloruro KCC2, lo que lleva a un cambio negativo en el potencial de inversión de los iones de cloruro [20, 38, 40]. Los insultos durante tales ventanas de tiempo de desarrollo pueden inducir consecuencias a largo plazo [27, 40]. Aquí propusimos que la inflamación neonatal puede alterar la expresión de KCC2, lo que afecta el cambio GABAérgico durante el desarrollo, lo que puede contribuir al deterioro cognitivo duradero. Como era de esperar, nuestros resultados demostraron que la inflamación neonatal aumentó la expresión de KCC2, manteniendo así una menor concentración de Cl– intracelular, como lo demuestra un EGABA hiperpolarizado. En particular, la eliminación de la expresión de KCC2 alivió el deterioro cognitivo inducido por la inflamación neonatal y revirtió el EGABA hiperpolarizado. Para determinar si KCC2 es un objetivo corriente abajo de IL-1β, examinamos la expresión de KCC2 y EGABA después de la inyección de IL-1β-siRNA en ratas LPS. Como resultado, la eliminación de la expresión de IL-1β puede revertir la expresión modificada de KCC2 y EGABA. Por lo tanto, nuestros hallazgos indican que la regulación positiva de KCC2 durante el desarrollo medió los efectos de los niveles elevados de IL-1β en el deterioro cognitivo de larga duración. Mientras que, Corradini et al. informaron que la infección materna con ácido poliinosínico-policitidílico (PolyI:C) provoca una regulación a la baja de la transcripción de KCC2 en la corteza de los ratones descendientes, lo que lleva a un cambio GABAérgico excitatorio a inhibidor retardado y una mayor susceptibilidad a las convulsiones in vivo, que perdura hasta la edad adulta [27]. Estas anomalías no se observaron en ratones knockout para el receptor de interleucina-1 tipo I [27]. Sus hallazgos parecen ser contrarios a nuestros resultados, que pueden resultar de las diferentes regiones del cerebro y la ventana de tiempo de la inflamación. Estudios previos han confirmado que la función de la transmisión GABAérgica dependía de la región, como la corteza frente al hipocampo [18,19,20]. Además, la dosis más alta de LPS utilizada en el presente estudio también puede contribuir a tal discrepancia. En resumen, tanto sus hallazgos como los nuestros aquí sugirieron un vínculo entre IL-1β/KCC2 y el cambio GABAérgico durante el desarrollo; y confirmó que el cambio GABAérgico anormal, ya sea aceleración o retraso, puede conducir a defectos del neurodesarrollo.

Gómez et al. encontraron que la inflamación en la vida temprana aumenta la excitabilidad de la neurona piramidal CA1 en ratones machos adultos, como lo demuestra un potencial de reversión de GABA despolarizado que resulta de una mayor expresión de NKCC1 [13]. Por lo tanto, tanto sus hallazgos como los nuestros destacan el papel de la homeostasis del cloruro en las propiedades intrínsecas de la membrana de larga duración en las neuronas del hipocampo después de la inflamación temprana, aunque existen algunas discrepancias. En nuestro presente estudio, no observamos una diferencia de sexo significativa en el deterioro cognitivo a largo plazo inducido por inflamación severa neonatal. Además, nuestros resultados mostraron que la regulación positiva de KCC2 desempeña un papel causal. Los puntos de tiempo de la administración de LPS pueden ser la causa principal de la discrepancia: la inyección de LPS indujo inflamación neonatal el día 14 posnatal (P14) en el estudio de Gomez [13], mientras que el LPS se inyectó en P3 en este estudio. En el estudio de Gómez et al. [13], las grabaciones de parches de las neuronas piramidales del hipocampo CA1 se realizaron en la adolescencia (P35-P45) o en la edad adulta (P60-P70) y mostraron un EGABA despolarizado. Durante este estudio, las grabaciones de parche se registraron en P7-P10 y/o P14-P16 y mostraron un EGABA hiperpolarizado. La evidencia previa mostró que el cambio GABAérgico puede haber casi terminado después de P14 [20]; por lo tanto, la inflamación inducida en la etapa temprana frente a la etapa casi completa del cambio GABAérgico puede conducir a resultados diferentes. Además, la inflamación en la vejez cercana a la adolescencia puede ser propensa a causar trastornos cognitivos dependientes del sexo. Es de destacar que, como se mencionó anteriormente, la dosis más alta de LPS utilizada en el presente estudio también puede contribuir a tal discrepancia. A diferencia de la dosis de LPS (0,1 mg kg-1, ip) en el estudio de Gomez [13] y otro estudio [41], usamos una dosis más alta de LPS (1 mg kg-1, ip) que resultó en ~ 40% mortalidad. Por lo tanto, una dosis tan alta de LPS se parece más a un modelo de sepsis que a una inflamación neonatal. Es importante destacar que realizamos experimentos de comportamiento y demostramos que la regulación positiva de KCC2 y el cambio GABAérgico acelerado contribuyen de manera importante a las deficiencias cognitivas inducidas por la inflamación neonatal. Una limitación es que no probamos si se observó un efecto similar en ratas adultas como informaron Gómez y colegas [13]. Se necesitan estudios futuros para explorar si el efecto de la inflamación neonatal se limita a una ventana de tiempo específica.

Además de KCC2, NKCC1 también juega un papel fundamental en el desarrollo neuronal del cerebro inmaduro [18, 42]. Se ha sugerido que NKCC1 es un objetivo terapéutico importante para varias enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, el deterioro cognitivo en un modelo murino de esquizofrenia se asoció con el potencial de inversión de las corrientes GABAA en las neuronas piramidales de la corteza prefrontal infralímbica que resultó de una mayor expresión de NKCC1, que podría mejorarse con bumetanida [43]. En un modelo de ratón con síndrome de Down, la caída de NKCC1 in vivo rescata los déficits cognitivos en diversas tareas conductuales [44]. El tratamiento con bumetanida, un antagonista de NKCC1, durante un período de desarrollo vulnerable rescata la epilepsia en un modelo genético de ratones con epilepsia [45]. Además, Gomez y sus colegas han confirmado el papel de NKCC1 en las propiedades intrínsecas de la membrana inducidas por la inflamación en las primeras etapas de la vida en las neuronas del hipocampo [13]. Sin embargo, un estudio reveló que NKCC1 en las neuronas glutamatérgicas telencefálicas parece no ser esencial para los aspectos principales del desarrollo del hipocampo [46]. En futuros estudios, será interesante determinar el papel de NKCC1 en el deterioro cognitivo inducido por inflamación neonatal.

En el presente estudio, las ratas fueron evaluadas tanto para el condicionamiento del miedo con claves contextuales dependientes del hipocampo como independientes del hipocampo [47]. La inflamación grave neonatal afectó al condicionamiento contextual dependiente del hipocampo pero no al miedo. Estos datos, junto con los resultados del aprendizaje espacial y la memoria detectados por las pruebas cognitivas del laberinto acuático de Morris dependientes del hipocampo, resaltan la importancia del hipocampo en el deterioro cognitivo duradero inducido por la inflamación grave neonatal.

La expresión de KCC2 y EGABA volvió a los niveles de control en ratas adolescentes después de la inflamación neonatal, lo que plantea la pregunta de cuál es la causa directa de la disfunción cognitiva a largo plazo en el momento de la medición del comportamiento. Aunque el presente estudio no propuso datos directos, es posible que KCC2 tenga funciones moduladoras multifacéticas en el desarrollo neuronal relacionadas con las funciones cognitivas, que incluyen principalmente establecer la fuerza y la polaridad de las corrientes de GABA durante la maduración neuronal, regulando la dinámica del citoesqueleto a través de su C-terminal. dominio, modulando la apoptosis del desarrollo, controlando los primeros eventos de la red, además de implicar en la formación y plasticidad de las espinas dendríticas corticales [18]. Por lo tanto, cualquier anomalía en cualquiera de las funciones mencionadas anteriormente puede contribuir a los defectos cognitivos a largo plazo inducidos por la inflamación neonatal. Por ejemplo, es posible que la inflamación temprana y/o el cambio GABAérgico influyan en el desarrollo de la transmisión glutamatérgica excitatoria [20, 48], lo que conduce a una función glutamatérgica alterada en la adolescencia. Se requieren estudios futuros para investigar por qué la regulación positiva de KCC2 en el período de desarrollo temprano causa deterioro cognitivo a largo plazo en la adolescencia o incluso en la edad adulta.

Cabe señalar que existen efectos bien conocidos del transporte para las madres preñadas [49, 50]. Por lo tanto, no se recomienda el transporte de madres preñadas para estudios de desarrollo y debe evitarse en futuros experimentos. En este estudio, aunque tanto los controles como las madres de cachorros inflamados estuvieron igualmente expuestos al transporte, existe la posibilidad de que pueda existir una interacción del estrés del transporte y la inflamación inducida por LPS.

En resumen, nuestros resultados destacan un vínculo mecánico entre la expresión de IL-1β/KCC2 y el deterioro cognitivo duradero en un modelo de inflamación grave neonatal y proporcionan un objetivo molecular subyacente para prevenir o tratar los trastornos cognitivos después de una inflamación séptica temprana.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Sistema nervioso central

Potencial de reversión de GABA

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Condicionamiento del miedo

Ácido γ-aminobutírico

Interleucina-1 beta

K+-Cl– co-transportador 2

lipopolisacárido

Laberinto de agua de Morris

Na+-K+-2Cl– cotransportador 1

Solución salina normal

Día postnatal 3

Potencial de membrana en reposo

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No aplica.

Este trabajo fue apoyado por la subvención No. 82071687 (a Han Huang) y No. 81974164 (a Cheng Zhou) de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China; Beca No. 2021M692276 (a Donghang Zhang) de la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China; y Subvención No. 21PJ014 (a Donghang Zhang) del Programa de la Comisión de Salud de la Provincia de Sichuan.

Donghang Zhang, Yujiao Yang y Yaoxin Yang contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Anestesiología, Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, Chengdu, 610041, China

Donghang Zhang, Yaoxin Yang, Jin Liu y Tao Zhu

Laboratorio de Anestesia y Medicina de Cuidados Críticos, Centro de Investigación de Ingeniería Conjunta Nacional-Local de Medicina Traslacional de Anestesiología, Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, Chengdu, 610041, China

Donghang Zhang, Yaoxin Yang, Jin Liu y Cheng Zhou

Departamento de Anestesiología, Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina del Norte de Sichuan, Nanchong, 637000, China

yujiao yang

Departamento de Anestesiología y Laboratorio Clave de Defectos Congénitos y Enfermedades Relacionadas de Mujeres y Niños, Ministerio de Educación, Segundo Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, Chengdu, 610041, China

hanhuang

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CZ y HH contribuyeron al diseño del estudio. DZ, YY1 y YY2 contribuyeron a la realización del estudio. CZ, DZ, JL y TZ contribuyeron al análisis de datos. CZ, DZ y HH redactó el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Han Huang o Cheng Zhou.

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan (Ref: 2020013) (Chengdu, Sichuan, China) y se llevó a cabo de acuerdo con las pautas de Investigación con animales: informes de experimentos in vivo (ARRIVE). No se incluyeron seres humanos en este estudio.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Imágenes originales para resultados de transferencia Western.

Mesa. S1: Información estadística para la figura 1. Tabla. S2: Información estadística para la Fig. 2. Tabla. S3: Información estadística para la Fig. 3. Tabla. S4: Información estadística para la Fig. 4. Tabla. S5: Información estadística para la Fig. 5. Tabla. S6: Información estadística para la figura complementaria 1. Tabla. S7: Información estadística para la figura complementaria 2. Tabla. S8: Información estadística para la figura complementaria 4. Tabla. S9: Información estadística para la figura complementaria 5. Tabla. S10: Información estadística para la figura complementaria 6. Tabla. S11: Información estadística para la figura complementaria 7.

Fig. S1: Tarea MWM y prueba FC para ratas macho y hembra después de la inflamación neonatal. Fig. S2: resultados de transferencia Western que muestran los niveles de proteína de IL-1β hipocampal en P7, P14 y P30 después de la exposición a LPS. Fig. S3: Imágenes representativas que muestran la fluorescencia transportada por IL-1β-siRNA o KCC2-siRNA. Fig. S4: Los niveles de ARNm y proteína de KCC2 del hipocampo con desarrollo en ratas de ambos sexos. Fig. S5: Los niveles de ARNm de IL-1β y KCC2 del hipocampo en ratas P7, P14 y P30 después de la inyección de ARNip. Fig. S6: Los niveles de proteína de IL-1β del hipocampo en ratas P7, P14 y P30 después de la inyección de siRNA. Fig. S7: Los niveles de proteína de KCC2 del hipocampo en ratas P7, P14 y P30 después de la inyección de siRNA.

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Zhang, D., Yang, Y., Yang, Y. et al. La inflamación grave en los recién nacidos induce un deterioro cognitivo a largo plazo mediante la activación de la señalización de IL-1β/KCC2 durante el desarrollo temprano. BMC Med 20, 235 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02434-w

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Recibido: 07 marzo 2022

Aceptado: 13 junio 2022

Publicado: 27 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02434-w

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