novela venetina

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 18497 (2022) Citar este artículo

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La presente investigación muestra la actividad antitumoral de un complejo proteína-polisacárido Venetina-1 obtenido a partir del líquido celómico de las lombrices de tierra Dendrobaena veneta contra las células cancerosas A549. Las investigaciones son una continuación de los experimentos sobre la actividad antitumoral del fluido celómico obtenido de esta especie. La nanopartícula de Venetina-1 se obtuvo tras el tratamiento térmico del fluido celómico, la separación de los celomocitos, la filtración y la liofilización. La preparación mostró un efecto selectivo sobre las células cancerosas, mientras que las células normales no se vieron afectadas. Venetin-1 fue eficaz contra las células de cáncer de pulmón en dosis de 31,3 y 62,5 µg/ml, y los resultados se obtuvieron mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM). Las células murieron principalmente a través de la vía de la apoptosis. Las células necróticas aparecieron esporádicamente en la vista microscópica. Las imágenes SEM revelaron la destrucción completa de las células A549 después de la incubación con Venetin-1. Los análisis de microscopía de fuerza atómica (AFM) mostraron cambios en la topografía, imágenes de error de fuerza máxima y módulo de Young (elasticidad) de las células A549 después de la incubación con Venetin-1. El análisis de criomicroscopía electrónica de transmisión (Cryo-TEM) indicó una naturaleza polimérica de la preparación analizada. Las muestras de Venetin-1 mostraron un perfil de tamaño muy homogéneo con un tamaño de micropartícula de aproximadamente 58,23 nm. Se observó una disminución significativa en la unión de Venetin-1 a la esfingomielina. Venetin-1 perdió su actividad de formación de poros o se produjo la desactivación de la actividad de formación de poros. Esto confirma la ausencia de capacidad hemolítica de Venetin-1 hacia los glóbulos rojos. Los análisis realizados muestran la idoneidad del complejo obtenido para la investigación biomédica. El próximo paso consistirá en analizar el efecto de Venetin-1 sobre el sistema inmunológico en ratones.

En el grupo de las enfermedades no transmisibles, los cánceres son las causas más comunes de muerte. El cáncer de pulmón se caracteriza por la mayor mortalidad entre hombres y mujeres en todo el mundo1,2. Fumar cigarrillos es la causa más común de desarrollo de cáncer de pulmón. El humo del tabaco contiene alrededor de 4000 sustancias, con aproximadamente 50 compuestos clasificados como tóxicos, irritantes o cancerígenos1,3,4. Las personas expuestas al tabaquismo pasivo también corren el riesgo de padecer cáncer de pulmón. Los metabolitos de la nicotina se pueden detectar en la orina del fumador pasivo, lo que indica que los no fumadores inhalan varios componentes del humo del tabaco3. Los componentes del humo del tabaco causan trastornos en el genoma celular, por ejemplo, deleción o amplificación del ADN, metilación incorrecta e incluso pérdida o ganancia de cromosomas completos2.

Aunque el 85% de los cánceres de pulmón se desarrollan en fumadores de tabaco, el resto de casos se diagnostican en quienes nunca han fumado. Una de las causas no relacionadas con el tabaco de los cánceres de pulmón es la contaminación del aire, predominantemente la presencia de oxígeno sulfuroso, oxígeno nitrogenado o polvo con un diámetro inferior a 2,5 µm5,6. En los EE. UU., la principal causa de cáncer de pulmón es el radón, es decir, el producto de la descomposición del radio presente en el suelo. Este gas es la causa del 40% de las muertes por cáncer, y la mayoría de estos pacientes son no fumadores de por vida1. Los investigadores también han identificado genes responsables de la susceptibilidad al desarrollo de cáncer de pulmón, es decir, mutaciones de la línea germinal en los genes p53 y EFGR, polimorfismo del gen SNP o trastornos en los genes de reparación del ADN, por ejemplo, ERCC12,7.

Los cánceres de pulmón se diagnostican en personas de alrededor de 70 años. Se pueden clasificar en dos tipos principales: SCLC (carcinoma de pulmón de células pequeñas) y NSCLC (carcinoma de pulmón de células no pequeñas). Aproximadamente el 85% de los cánceres de pulmón son NSCLC2. Suelen tener mal pronóstico debido a la detección tardía y al estadio avanzado del desarrollo del cáncer8. Los SCLC a menudo se ubican en las vías respiratorias más grandes, lo que provoca oclusiones bronquiales. Estos cánceres suelen ser bastante grandes y, a menudo, hacen metástasis en los ganglios linfáticos9.

Se ha documentado que muchos compuestos de origen vegetal, fúngico o animal pueden destruir las células de cáncer de pulmón. Por ejemplo, el extracto de albahaca asiática de Ocimum sanctum exhibió citotoxicidad para las células de cáncer de pulmón A549, aumentó la población sub-G1 e influyó en la aparición de cuerpos apoptóticos en las células cancerosas10. Otros estudios mostraron que Phyllanthus podía inducir toxicidad selectiva en las células A549. Además, ejercía un efecto inhibidor en las etapas críticas de la metástasis, incluida la migración y la invasión11. Por su parte, Ramalakshmi et al.12 encontraron actividad citotóxica del extracto etanólico de hojas de Coleus amboinicus contra células de cáncer de pulmón A549. Su citotoxicidad después de 72 h de incubación con células de cáncer de pulmón A549 fue del 94%.

Wei-Sheng et al.13 demostraron que la bostricina (hidroxi-metoxi-tetrahidro-5-metilantraceno) de hongos marinos inhibía la proliferación de células A549 de manera dependiente de la dosis y el tiempo de incubación, detenía el ciclo celular en G0/G1 y apoptosis estimulada. Se demostró que la picnidiona aislada del hongo Theissenia rogersii reduce la proliferación de células de adenocarcinoma de pulmón A549 a través de la detención del ciclo celular en la fase G1. Además, se descubrió que estimula la apoptosis a través de vías externas e internas. La picnidiona también causó una disminución en el potencial de la membrana mitocondrial y un aumento significativo en el nivel de especies reactivas de oxígeno y proteína PAI-1 en células A54914. En la medicina china, las propiedades anticancerígenas de los compuestos aislados de Ganoderma spp. contra el cáncer de pulmón son bien conocidas15.

En cuanto a los preparados de origen animal, Arulvasu et al.16 demostraron que la emulsión de aceite de sardina (Sardinella longiceps) inducía la apoptosis e inhibía la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 de forma dependiente de la dosis y el tiempo de incubación. El probable mecanismo de acción de los ácidos Ω-3 consiste en la interacción con la membrana celular y la inhibición de las enzimas de la membrana, lo que conduce a la apoptosis de las células neoplásicas. Respecto a los invertebrados, se ha observado que las proteínas del líquido celómico de las lombrices de tierra también muestran actividad antitumoral, por ejemplo contra el cáncer de pulmón17.

Las lombrices de tierra son una fuente de sustancias anticancerígenas. Estos anélidos se utilizan en la medicina del Lejano Oriente, por ejemplo, en Vietnam, China o Corea, para el tratamiento de muchas enfermedades, por ejemplo, quemaduras, asma, bronquitis, enfermedades cardiovasculares o úlceras gastrointestinales17,18. En su hábitat, que tiene una rica microbiota y asegura un contacto constante entre los microorganismos y las lombrices, estos animales han desarrollado mecanismos que impiden el desarrollo de enfermedades18,19,20,21. Las formulaciones más populares a base de lombrices son los polvos y las pastas20,21,22,23,24. Se ha evidenciado que el fluido celómico es rico en proteínas, enzimas, péptidos y polisacáridos. Tiene propiedades fibrinolíticas, ejerce efectos vasorelajantes y tiene propiedades beneficiosas para el hígado17,18,22. Los preparados de lombrices de tierra tienen propiedades antibacterianas y antifúngicas documentadas20,21,24,25,26,27,28. La investigación actual ha demostrado que el líquido celómico tiene actividad anticancerígena contra las líneas celulares de cáncer HeLa, A549, Pa17, PC-12 o Hep-220,26,29. Se ha propuesto un mecanismo de acción del fluido celómico contra las células cancerosas basado en la limitación de la captación de glucosa por las células20. Además, se ha demostrado que el fluido celómico no tiene efectos citotóxicos contra los fibroblastos o eritrocitos humanos25,30. Estas propiedades hacen que los productos derivados de lombrices sean agentes prometedores en la terapia contra el cáncer.

Los efectos de Venetin-1 sobre la proliferación de las células BEAS-2B y A549 se determinaron con el uso del ensayo MTT durante 24, 48 y 72 h (Fig. 1). Aunque la línea celular A549 fue viable en aproximadamente un 80-90 % después de la exposición de 24 y 48 h a las diferentes concentraciones de Venetin-1 (15,6-500 μg/mL), su viabilidad después de la incubación de 72 h disminuyó significativamente al 52 %. , 41 % y 32 % a las concentraciones de Venetin-1 de 125 μg/mL, 250 μg/mL y 500 μg/mL, respectivamente (Fig. 1A). La viabilidad de las células BEAS-2B disminuyó al 75 % en el grupo tratado con 500 μg/mL de Venetin-1 a las 72 h (Fig. 1B). En las concentraciones más bajas, las células BEAS-2B parecieron exhibir una mayor tolerancia a Venetin-1, con una mayor viabilidad (80-100 %) en todas las demás concentraciones de Venetin-1 después del período de 72 h.

Resultados del ensayo MTT y efectos de las concentraciones indicadas de Venetin-1. (A) Curvas de dosis-respuesta para Venetin-1 en células A549 después de incubación de 24 h, 48 h y 72 h. (B) Comparación de la actividad citotóxica de Venetin-1 contra células A549 de cáncer de pulmón y células BEAS-2B normales después de 72 h de incubación. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) de 3 experimentos independientes. *p < 0,05; ** p < 0,01. Venetin-1 a la concentración en el rango de 125–500 μg/mL después de la incubación de 72 h causó una disminución significativa en la viabilidad de las células A549, pero no indujo cambios significativos en la viabilidad de las células BEAS-2B.

La muerte celular apoptótica inducida por el extracto de Venetin-1 se investigó mediante el control de la translocación de fosfatidilserina (PS) mediante el ensayo de anexina V-FITC/PI. Según la capacidad de la anexina V para unirse a PS, que se localiza en la membrana interna de las células viables, las células se clasificaron de la siguiente manera: LL: células viables (anexina V-/PI-), LR: células apoptóticas tempranas ( Anexina V+/PI-), UR: células apoptóticas tardías (Anexina V+/PI+) y UL: células necróticas (Anexina V-/PI+).

Observamos que el tratamiento de 72 h con Venetin-1 tuvo un impacto necrótico y apoptótico en las células A549 (Fig. 2). El número de células viables se redujo significativamente de 77,03 ± 2,62 % en el control a 48,41 ± 0,92 % después de la incubación de 72 h con 125 µg/mL de Venetin-1. En comparación con las células de control, se observó una mayor cantidad de células necróticas (~ 5%) y apoptóticas tempranas (~ 3%) en las células A549 tratadas con Venetin-1. Además, las células exhibieron una tasa de apoptosis tardía notablemente más alta, en comparación con las células no tratadas (24,31 ± 0,57 frente a 2,18 ± 0,27) (Tabla 1). Los resultados de la actividad de Venetin-1 contra las células epiteliales de pulmón normales (BEAS-2B) se presentan en los materiales complementarios (Figura complementaria S1).

Actividad apoptótica y necrótica de Venetina-1 en células A549 evaluada con el ensayo de tinción de anexina V/PI. El panel (A) muestra diagramas de puntos representativos de células de control A549 (sin incubación con Venetin-1) después de la doble tinción con Anexina V-FITC y PI. El panel (B) muestra los efectos de la incubación con Venetin-1 (125 µg/ml) durante 72 h sobre la apoptosis celular en células A549. Las células se clasificaron como células viables (cuadrado inferior izquierdo), células apoptóticas tempranas (cuadrado inferior derecho), células apoptóticas tardías (cuadrado superior derecho) y células necróticas (cuadrado superior izquierdo). Se muestran imágenes representativas de tres experimentos independientes. Venetin-1 tuvo un efecto necrótico y apoptótico en las células A549. La tasa de necrosis así como la apoptosis temprana y tardía en las células A549 tratadas con Venetin-1 fue mayor en un 5 %, 3 % y 22,13 %, respectivamente, que en el control.

Para examinar el efecto potencial del tratamiento con Venetin-1 en el ciclo celular, las células A549 se trataron con 125 µg/ml de Venetin-1 durante 72 h, se tiñeron con PI y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 3, las células A549 tratadas se detuvieron en la fase sub-G1 con un aumento sustancial (p < 0,0001) en el número de células apoptóticas (1,13 ± 0,08 % frente a 36,63 ± 0,61 %). La incubación con Venetin-1 también provocó una disminución concomitante en la proporción de células en el G1 (40,94 ± 0,94 % frente a 30,44 ± 0,57 %, p = 0,0001), S (25,56 ± 0,65 % frente a 18,36 ± 0,50 %, p = 0,0001) y G2/M (31,36 ± 0,35 % frente a 15,32 ± 0,38 %, p < 0,0001) del ciclo celular en las células A549 tratadas, en comparación con el control.

Efecto del tratamiento con Venetin-1 en las fases del ciclo celular A549. (A) Análisis del ciclo celular por citometría de flujo en células de control A549 y aquellas tratadas con Venetin-1 (125 µg/mL) durante 72 h. La distribución del ciclo celular de las células marcadas con PI se analizó mediante análisis de citometría de flujo. Los picos en la ilustración corresponden a las fases sub-G1 (puerta M1), G1 (puerta M2), S (puerta M3) y G2/M (puerta M4) del ciclo celular. (B) Histograma que muestra los porcentajes de células en cada fase del ciclo celular. Los resultados se expresan como valores medios ± DE de tres experimentos independientes. Los valores de p inferiores a 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01), en comparación con el grupo de control, se consideran estadísticamente significativos. El tratamiento con Venetin-1 provocó la detención de las células A549 en la fase sub-G1 con un aumento en el número de células apoptóticas y una reducción visible en las proporciones de células A549 tratadas y de control en las otras fases del ciclo celular.

El nivel de caspasas 3, 6, 8, 9, 12 y 18 se determinó en homogeneizados de células normales y neoplásicas con y sin Venetin-1 (Fig. 4). En el cultivo de células de cáncer de pulmón A549, el nivel de cada una de las caspasas probadas fue mayor en los cultivos suplementados con Venetin-1 a la concentración de 125 µg/mL que en los cultivos no tratados. El nivel de caspasas en el cultivo de células BEAS-2B normales con la adición de Venetin-1 a la concentración de 125 µg/mL no difirió significativamente entre los dos grupos estudiados.

Concentraciones de caspasas 3, 6, 8, 9, 12 y 18 en cultivos celulares BEAS-2B y A549. * p < 0,05. El mayor aumento en la concentración de las caspasas probadas se observó en el cultivo de células de cáncer de pulmón A549 tratadas con Venetin-1.

Después de la incubación con Venetin-1 (125 µg/mL), el mayor aumento en la concentración de caspasas 3, 6, 8 y 9 se registró en el cultivo de células de cáncer de pulmón A549. El mayor aumento en la concentración de caspasa 12 se registró en el cultivo de células de cáncer de pulmón A549 incubadas con el compuesto activo (Fig. 4). Se notó una ligera disminución en la concentración de caspasa 12 en el cultivo de células BEAS-2B con la adición de Venetin-1 (125 µg/mL). El mayor aumento en la concentración de caspasa 18 después de la incubación con Venetin-1 se observó en el cultivo de células de cáncer de pulmón A549. Se observó una ligera disminución en la concentración de caspasa 18 en el cultivo de células normales incubadas con Venetin-1. Los datos completos están disponibles en Materiales complementarios (Tabla complementaria S2).

El análisis del cultivo de control A549 y variantes incubadas con 62,5 y 125 µg/mL de Venetin-1 mostró que las células tratadas con la fracción activa se notaban menos claramente debajo del cristalino y estaban deformadas. Se observaron con frecuencia cambios citopáticos en las células. Además, eran visibles células fuertemente degradadas o en desintegración (Fig. 5a).

Visualización de células A549 tratadas con Venetin-1 con el uso de luz transmitida y microscopía de fluorescencia: (a) efecto citotóxico de Venetin-1 en A549. A: cultivo de control de A549, B: A549 después de 72 h de incubación con Venetin-1 (62,5 µg/ml) con una citotoxicidad del 78 %; C1, C2: A549 después de 72 h de incubación con Venetin-1 (125 µg/mL) con una citotoxicidad del 48 %. Las células se visualizaron usando un microscopio Zeiss Axiovert 40CFL (Carl Zeiss). La barra de escala corresponde a 20 µm. Las imágenes representan 10 imágenes. Las células tratadas con Venetin-1 se deformaron y degradaron; ( b ) efectos apoptóticos y necróticos en células A549 después de 72 h de incubación con Venetin-1. A: cultivo de control de A549, B: células A549 tratadas con Venetin-1 (62,5 µg/ml), C1, C2: células A549 tratadas con Venetin-1 (125 µg/ml). Las flechas amarillas indican células apoptóticas con clara degeneración progresiva del núcleo. Las células rosadas se consideran necróticas. Las barras de escala corresponden a 50 µm. Cada imagen representa 10 fotos capturadas.

También se tomaron imágenes de los cultivos observados bajo el microscopio de luz transmitida usando un microscopio confocal después de la aplicación de una mezcla de colorantes fluorescentes para identificar las células necróticas y apoptóticas. Las células de control se caracterizaron por un núcleo fluorescente oscuro regular. Las células incubadas con Venetin-1 a las concentraciones de 62,5 y 125 µg/mL tenían núcleos luminosos brillantes con material genético frecuentemente fragmentado. Las células que muestran signos de apoptosis están marcadas en la imagen con flechas. Las células necróticas eran esporádicas y emitían fluorescencia roja (Fig. 5b).

El cultivo de control y las células incubadas con Venetin-1 a la concentración de 125 µg/mL se observaron utilizando la técnica DIC. La técnica asegura el efecto de una superficie tridimensional. Se observó que las células A549 de control eran visiblemente más densas y compactas en la vista microscópica, como lo indica su color más oscuro y una mayor diversidad de la superficie observada (Fig. 6a A). Después del tratamiento con Venetin-1, las células se contrajeron, lo que se evidenció por la pigmentación oscura concentrada en la superficie celular más cercana a su centro (Fig. 6a B1, B2). La microscopía electrónica de barrido de las células tumorales facilitó la comparación de sus superficies entre los grupos de control y de incubación con Venetin-1 (125 µg/mL). La superficie de las células de control era rica en estructuras granulares finas (Fig. 6a A1, A2), mientras que las células tratadas con Venetin-1 no tenían estos gránulos y su superficie celular mostraba restos de estructuras dañadas (Fig. 6b B1, B2 ). El efecto de contracción celular también fue visible como grietas perceptibles en la imagen microscópica (Fig. 6b B1).

Análisis DIC y SEM de células A549 después de la exposición a Venetin-1: (a) imágenes DIC de células A549 después del tratamiento con Venetin-1 A—cultivo de control de células A549 B1, B2—A549 después de la incubación con Venetin-1 (125 µg/mL ). Las barras de escala corresponden a 20 µm. ( b ) Imágenes SEM de la superficie de las células A549 después del tratamiento con Venetin-1. A1, A2—cultivo de control de células A549, B1, B2—A549 después de la incubación con Venetin-1 (125 µg/mL). Las barras de escala corresponden a 10 µm. Después de la incubación con Venetin-1, la contracción y degradación de las estructuras celulares eran visibles en la superficie de las células A549. Cada imagen representa 10 fotos capturadas.

Las imágenes topográficas y de error de fuerza máxima capturadas por AFM en la superficie de las células A549 incubadas con 125 µg/mL de Venetin-1 revelaron diferencias (Fig. 7B1, B2) con respecto a las células de control (Fig. 7A1, A2). La amplitud media de las células de control A549 sujetas a la medición de la altura fue dos veces menor que la amplitud media de las células tratadas con Venetin-1. Las células A549 incubadas con Venetin-1 tenían una superficie marcadamente variada con hendiduras visibles en el perfil de altura (Fig. 7B1, B2). Con el fin de determinar las áreas de la superficie celular con la elasticidad más baja y más alta, se hizo un mapa de módulo de Young y se compararon los valores del módulo de Young para las áreas dadas. El valor medio del módulo de Young de las áreas con mayor elasticidad fue de 2120,7 MPa en el control y de 1142,8 MPa en las células A549 tratadas con Venetin-1. El módulo de Young de las áreas con menor elasticidad fue 2,3 veces menor (2647,4 MPa) en las células A549 incubadas con Venetin-1 que en las células control (6300,9 MPa). En ambos casos, las diferencias fueron estadísticamente significativas (p < 0,001; prueba t de Student). Las imágenes de AFM indicaron cambios morfológicos y biofísicos apoptóticos en las células A549 causados ​​por el tratamiento con Venetin-1.

Análisis AFM de la superficie de la pared celular A549. (A1, A2) Cultivo de control de A549, (B1, B2) Células cancerosas incubadas con 125 µg/ml de Venetin-1. Imagen de gran altitud y error de fuerza máxima: panel izquierdo; perfil de altura e imagen 3D—panel derecho. El tratamiento con Venetin-1 provocó cambios en la topografía de la pared celular y las propiedades mecánicas de las células A549, y se observó una elasticidad significativamente menor expresada como módulo de Young.

Antes de la digestión enzimática de los componentes proteicos de Venetin-1 y DVr (fluido celómico crudo), las muestras se redujeron con DTT y se sometieron a separación electroforética en el sistema automático SageELF. Las proteínas se separaron en el modo basado en el tamaño en el rango de 10 a 300 kDa. Después de la separación, el sistema eluyó automáticamente las proteínas del gel en pozos separados en el casete, desde los cuales se pipetearon en tubos Eppendorf y se digirieron de acuerdo con el protocolo FASP (cada fracción por separado). Los resultados de identificación de proteínas para Venetina-1 en cada fracción se presentan en la Tabla 2 (todos los resultados están disponibles en los Materiales complementarios, Tabla S3 para Venetina-1 y S4 para líquido celómico crudo DVr). La identificación se llevó a cabo en base a la base de datos de proteínas revisada para Annelida (Uniprot).

Se determinó la unión de la preparación de Venetin-1 y su precursor, DVr (líquido celómico crudo) recolectado de lombrices de tierra y sin procesar (sin calentamiento ni diálisis) a dos lípidos: esfingomielina y POPC. Se prepararon soluciones de liposomas de 3 mM de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección de Materiales y Métodos. Los lípidos se depositaron en el sensor L1 diseñado para estudiar la interacción de proteínas con lípidos. Luego, luego de bloquear el sensor con una solución de albúmina, se realizó el procedimiento de unión de ambas preparaciones, y las proteínas unidas fueron eluidas y sometidas a análisis proteómico. Los sensogramas presentados en la Fig. 8 muestran la unión de las preparaciones a los lípidos. Hubo una reducción significativa en la unión de Venetina-1 a la esfingomielina en comparación con la preparación de DVr sin procesar. Se detectó una unión más baja de DVr al lípido POPC. La unión de Venetin-1 a POPC fue más débil y se asoció con un desprendimiento rápido del complejo.

Análisis SPR de extractos de proteínas (DVr—líquido celómico crudo y Venetin-1) que se unen a SM (esfingomielina) y POPC (1-palmitoil-2-deoilphpesfatidilcolina). Los cambios observados estaban relacionados con la reducción de la unión de Venetina-1 a la esfingomielina en comparación con la preparación de DVr sin procesar, la menor unión de DVr al lípido POPC y la unión más débil de Venetina-1 a POPC.

El análisis proteómico de las fracciones recuperadas de los experimentos SPR mostró que solo se identificó una proteína en cada caso, a saber, la proteína 2 relacionada con la lisenina (LRP2). La cobertura de secuencia más alta y la mayoría de los péptidos se identificaron en DVr. Para obtener más información, consulte la Tabla S5 en los Materiales complementarios.

El compuesto activo Venetin-1 era visible bajo un microscopio de barrido como pequeños copos de varios tamaños. Las estructuras más largas tenían una longitud de aproximadamente 200 µm (Fig. 9A1, A2). También se observó la estructura de la preparación mediante la técnica Cryo-TEM. Se notó que las estructuras más pequeñas se agruparon para formar una estructura circular más grande. La acumulación de las estructuras más pequeñas está indicada por el círculo blanco en la Fig. 9B, mientras que las estructuras sueltas están indicadas por flechas. Una forma compacta y redonda es visible en la parte superior de la muestra. La imagen observada sugiere que la estructura de Venetin-1 es característica de un compuesto polimérico.

Imágenes de Venetin-1: (A1, A2) imágenes SEM de Venetin-1; (B) Imágenes Cryo-TEM de Venetin-1. La imagen muestra pequeñas estructuras agrupadas en una más grande (marcada con un círculo blanco). Las estructuras sueltas están marcadas con flechas. Una estructura compacta circular oscura formada por partículas más pequeñas es visible en la parte superior de la imagen.

El análisis mostró la presencia de carbono (64,1%), oxígeno (23,5%), nitrógeno (6,3%), fósforo (1,6%) y azufre (0,3%). Todos estos elementos son característicos de las proteínas. Las pruebas también mostraron la presencia de cloro (3,0%) y sodio (1,3%).

El espectro de la encuesta XPS de Venetin-1 se muestra en la Fig. 10. Los resultados cuantitativos del análisis XPS de la composición elemental de la superficie de Venetin-1 se presentan en la Tabla 3.

Espectro de sondeo XPS de Venetin-1. Se detectaron elementos característicos de las proteínas, entre ellos: carbono, nitrógeno, fósforo y azufre; además, se demostró la presencia de cloro y sodio.

Para identificar los enlaces químicos presentes en la preparación analizada, se obtuvieron espectros en un rango estrecho de energías de enlace para carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo. Después de una operación de ajuste de selección basada en los datos de la literatura, los enlaces químicos se ajustaron para las energías de enlace individuales. La Figura 11 muestra los espectros en un rango estrecho de energía de enlace XPS. La Tabla 4 presenta la composición elemental de Venetin-1 con identificación de enlaces químicos característicos.

Espectros XPS de Venetin-1 en un rango estrecho de energías de enlace para: (a) carbono, (b) oxígeno, (c) nitrógeno, (d) fósforo, (e) azufre.

El estudio mostró las características de unión tanto de los polisacáridos como de las proteínas. Los espectros en el rango estrecho de energías de unión para el carbono mostraron la presencia de enlaces C–C, C–H, C–OH, C=O y C–O–C en los polisacáridos. También se observó la presencia del enlace carboxílico O=C–OH característico de las proteínas. También se encontraron los grupos C=O y C–N característicos del enlace peptídico. Las pruebas realizadas en el rango de energía de enlace estrecho característico del nitrógeno mostraron la presencia de nitrógeno en forma de enlaces amina. Estos enlaces son característicos de las proteínas. La presencia de la forma orgánica de fósforo y azufre también confirma la presencia de proteínas en la preparación ensayada.

Como se ve en la Fig. 12 y la Tabla 5, las muestras muestran un perfil de análisis de tamaño muy homogéneo con un tamaño de micropartícula determinado en 58,23 ± 3,93 nm.

Prometheus Panta DLS análisis de tamaño de micropartículas Venetin-1. La preparación resultó ser homogénea en el perfil de tamaño.

Luego del análisis de tamaño realizado con Prometheus Panta, se realizó un experimento de temperatura de fusión con un gradiente de temperatura de 25 a 95 °C y una rampa de calentamiento de 1 °C/min (Cuadro 6). Como se muestra en la Fig. 12, las micropartículas mostraron una transición única de 350/330 nm a una temperatura de 64,95 ± 0,08 °C. Esta transición muy probablemente correspondía al punto de fusión de las micropartículas analizadas. Además, se determinó que, luego del cambio conformacional representado por la relación de fluorescencia 350/330 nm, las micropartículas analizadas sufrieron agregación con el Tagg 66.92 ± 0.16 °C e inicio de agregación 58.97 ± 1.15 °C.

Las fuentes renovables de productos medicinales de origen animal, las preparaciones farmacéuticas basadas en estas fuentes y los aditivos alimentarios biológicos parecen ser parte integral del progreso en la búsqueda de agentes terapéuticos efectivos. Este tipo de actividad humana debe mejorarse en todos los sentidos posibles. Los modelos animales convenientes contribuyen al desarrollo de la medicina complementaria y alternativa llamada medicina integrativa. Invertebrados como las lombrices de tierra son económicos, éticamente no controvertidos y útiles para comprender los mecanismos subyacentes a los procesos biológicos37. El uso de productos farmacéuticos derivados de las lombrices de tierra está muy desarrollado como medicina verde en China y otros países asiáticos. Los extractos preparados a partir de estos invertebrados se utilizan para tratar muchas enfermedades. Entre los invertebrados, las lombrices de tierra son una fuente conocida de compuestos antibacterianos, antifúngicos y anticancerígenos. El fluido celómico de la cavidad del cuerpo de la lombriz exhibe muchos tipos de propiedades biológicas, por ejemplo, actividad antimicrobiana, proteolítica, hemolítica, hemaglutinante, antifúngica y antitumoral.

Nuestra investigación muestra que Venetina-1, caracterizada previamente como la fracción de proteína-polisacárido del fluido celómico de la lombriz de tierra D. veneta, tiene un efecto selectivo en las células de carcinoma de pulmón A549, destruyendo las células cancerosas y salvando las normales. La preparación se obtuvo a través de varios procesos, como la extracción del fluido mediante descarga eléctrica, centrifugación, filtrado, incubación y liofilización. Un paso particularmente importante fue privar al líquido de la citotoxicidad para las células normales mientras se mantenía su alta actividad contra las células tumorales. Estos procesos fueron descritos en la publicación que describe la acción de fracciones de líquido celómico en células de cáncer de pulmón A54929.

La preparación obtenida provocó la muerte celular apoptótica. Desde el punto de vista de la oncología moderna, la apoptosis es un proceso muy importante que debe activarse en las células cancerosas. Las células cancerosas son de naturaleza inmortal. Se intenta diseñar fármacos modernos para inducir la apoptosis (o algún otro tipo de muerte celular) solo en células anormales, dejando intactas las células sanas del cuerpo. En otras palabras, se induce farmacológicamente al tumor a cometer suicidio. La inducción del proceso de apoptosis es uno de los principales objetivos de las terapias anticancerígenas diseñadas. Esto está relacionado con los mecanismos desarrollados de resistencia de las células tumorales a la muerte programada. Los fármacos quimioterapéuticos actuales destruyen las células cancerosas principalmente a través de la inducción de la apoptosis. Sin embargo, se vuelven ineficaces cuando la célula neoplásica puede metastatizar, lo que se asocia con mal pronóstico y alta mortalidad38. Las células cancerosas suelen tener varias mutaciones genéticas que afectan el proceso apoptótico, evitando así la muerte celular programada. Esta resistencia a la apoptosis es beneficiosa para las células metastásicas38,39,40,41,42.

Las proteínas diana son proteolizadas por caspasas, lo que puede conducir a su activación o inhibición, ejerciendo así un impacto significativo en el destino futuro de la célula. Realizan muchas funciones importantes en el organismo. Sobre todo, estas proteínas juegan un papel clave en la apoptosis. Además, están implicados en otros mecanismos de muerte celular como la piroptosis, la necrosis y la autofagia. También son importantes en el funcionamiento del sistema inmunitario y en los procesos inflamatorios por estimulación de la secreción de citocinas proinflamatorias. También participan en los procesos de envejecimiento. Algunas caspasas tienen propiedades anticancerígenas43,44,45,46,47. Las caspasas iniciadoras (caspasas 2, 8, 9 y 10) están involucradas en la fase inicial de la apoptosis y su función es potenciar la señal de muerte. También son responsables de la activación de las caspasas efectoras (caspasas 3, 6, 7). A su vez, tras su activación, las caspasas ejecutoras descomponen rápidamente los elementos celulares43,47,48.

Los presentes resultados indican que Venetina-1 provoca un aumento estadísticamente significativo en la actividad de la caspasa en células de cáncer de pulmón A549 cultivadas. El aumento de la concentración de caspasa 3, que pertenece al grupo de las caspasas ejecutoras, y la disminución del número de células vivas en el cultivo pueden indicar una intensificación del proceso de apoptosis en estas células tumorales tras la adición de Venetin-1. Sin embargo, el aumento de caspasa 12 sugiere que esta preparación también puede ser importante en la inducción del proceso inflamatorio. El aumento de la concentración de caspasa 6 indica que Venetin-1 influye en la fase de ejecución de la apoptosis, y el aumento de la concentración de caspasas 8 y 9 refleja su influencia en la fase de iniciación. A su vez, no se encontraron cambios significativos en los parámetros ensayados tras la adición de Venetin-1 en el cultivo de células normales del epitelio bronquial del árbol bronquial BEAS-2B.

Las observaciones con microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido y microscopía de fuerza atómica revelaron cambios en la morfología y las propiedades nanomecánicas de las células tumorales después de la incubación con Venetin-1. Las imágenes microscópicas proporcionadas por las diferentes técnicas se complementaron entre sí. La microscopía de luz transmitida mostró una disminución en la densidad celular y deformación después de la incubación con el compuesto activo. Los cambios en los parámetros de la superficie celular A549, como la rugosidad, se detectaron mediante microscopía de fuerza atómica. La apoptosis temprana se caracteriza por la remodelación del citoesqueleto y el núcleo. Induce cambios dinámicos en las propiedades nanomecánicas de la superficie celular49. Macroscópicamente, la reducción de la densidad de cultivo también se evidenció con la técnica DIC.

El Venetin-1 aislado provocó un aumento significativo en el nivel de caspasas 3, 12 y 18 en las células de cáncer de pulmón A549 y al mismo tiempo indujo cambios en la viabilidad y densidad celular en estos cultivos. Esto indica que esta preparación ejerce su efecto antitumoral al estimular el proceso de apoptosis en las células de cáncer de pulmón A549.

Aunque describimos nuestra preparación como una fracción proteína-polisacárido, en realidad es un complejo, ya que los análisis electroforéticos previos del mismo mostraron que las señales provenientes de las proteínas estaban ubicadas exactamente en las mismas posiciones que las señales provenientes de los azúcares. Esto indica que estos compuestos de proteína y azúcar están relacionados entre sí. Además, los análisis de espectroscopia FTIR demostraron la homogeneidad química de la preparación, ya que el espectro FTIR se veía igual en cada región analizada y tenía la misma intensidad. Otra observación que respalda la naturaleza del complejo es la imagen Cryo-TEM de la preparación, que mostraba claramente estructuras idénticas más pequeñas fusionándose en una forma esférica más grande. Los análisis XPS de los enlaces químicos confirman esta teoría. Además, los análisis específicos del dominio de dispersión de luz dinámica llevados a cabo con el uso de Prometheus Panta mostraron que Venetin-1, anteriormente considerada como una fracción de proteína-polisacárido, era una nanopartícula.

Análisis químicos previos realizados en estudios sobre actividad antifúngica27,28,30 demostraron que las proteínas de la familia de la lisenina: proteína relacionada con la lisenina 2 (LRP2) y lisenina, que se identificaron con una precisión del 95 % y el 90 % de cobertura de secuencia, respectivamente, fueron los componentes principales de Venetin-1. La lisenina es una proteína de 33 kDa que se encuentra en el fluido celómico de las lombrices de tierra50. Probablemente, la lisenina es producida por celomocitos y cloragocitos libres, ya que se ha encontrado ARNm de lisenina en estas células. La lisenina se une específicamente a la esfingomielina (SM) y, cuando se une a las membranas celulares de las células diana, forma oligómeros de forma dependiente de la MS. Estas proteínas pertenecen al grupo de las toxinas formadoras de poros, que pueden ser responsables de la actividad biológica del preparado.

El sistema SageELF (fraccionamiento lateral electroforético) se utilizó para la separación de los componentes proteicos de DVr y Venetin-1. Se utiliza para el fraccionamiento de proteínas en una matriz de gel de agarosa SDS con elución simultánea. El software controla el tiempo de fraccionamiento según la señal del marcador fluorescente agregado durante los pasos de preparación de la muestra. De esta forma, las fracciones obtenidas se dividieron según el tamaño molecular de 10 a 300 kDa. El análisis proteómico confirmó la presencia de cantidades significativas de constituyentes en todos los eluatos. En el caso de Venetin-1, la mayor parte de la fracción 9 (eluida de 8 a 10) es la forma monomérica de lisenina, actina 2 y proteína relacionada con lisenina 2. Sin embargo, no es la única forma presente en el conjunto. preparación. Se observó una alta frecuencia de esta forma estimada por los parámetros del programa PeaksStudio (Tabla complementaria S3) en fracciones de mayor peso molecular, de las cuales se eluyeron moléculas con un peso de aproximadamente 260 kDa (fracción 1) a 100 kDa (fracción 4). Asumiendo que la masa del monómero es la masa de lisenina o LRP2 (33/34 kDa), estos pueden ser formas de trímero a octámero si son lisenina homogénea u oligómeros de LRP2 heterogéneos como una mezcla de lisenina y LRP2. Sus secuencias son muy similares (identidad 89%). Debido a la presencia de actina 2 (42 kDa) y, por ejemplo, fragmentos de ubiquitina identificados en todas las fracciones, también se supone que puede ser un complejo multiproteico. El análisis del sensograma reveló diferencias entre Venetin-1 y DVr en la interacción con los lípidos. Los datos de DVr son consistentes con los informes de la literatura que apuntan a las liseninas como proteínas que reconocen específicamente a la esfingomielina51. En el caso de Venetin-1, se observó una disminución significativa en la unión a la esfingomielina. Puede sugerir la pérdida de la capacidad de formar el poro completo característico de esta proteína o la formación de oligómeros no funcionales durante el calentamiento del fluido celómico crudo. Venetin-1 aún puede interactuar con SM, pero la interacción es mucho más débil. Esto también es visible en el caso de POPC, que imita las membranas de los mamíferos. DVr ejerce un efecto más débil que SM, pero la interacción en el caso de Venetin-1 es aún más débil. La identificación de proteínas de la fracción de recuperación reveló que la proteína 2 relacionada con la lisenina era una proteína de unión a lípidos para ambas preparaciones analizadas. LRP-2 presenta un 89 % de identidad y un 94 % de similitud con la secuencia de lisenina, y los datos de la literatura indican que LRP se une a SM e induce la hemólisis de los glóbulos rojos, al igual que la lisenina51. Estructuralmente, comparten sitios putativos de N-glicosilación y N-miristoilación. Los resultados muestran que la interacción de Venetin-1 con los lípidos se basa en LPR2 pero no en la lisenina.

Venetin-1 perdió su actividad formadora de poros o tuvo lugar la desactivación de la actividad formadora de poros. Esto fue confirmado por la falta de capacidad hemolítica de Venetin-1 hacia los glóbulos rojos y demostró una reducción significativa de la toxicidad de Venetin-1 contra las células sanas y la ausencia de hemólisis de RBC, en comparación con la preparación de DVr. La fracción DVr degradó los glóbulos rojos, mientras que su incubación con Venetin-1 no alteró estas células y no provocó la liberación de su contenido (datos no mostrados en el manuscrito). Así, la interacción de formas monoméricas u oligoméricas con la superficie de la membrana sin formación de poros y perforación de la membrana puede ser análoga en células cancerosas. El proceso de formación de poros consta de tres pasos principales en contacto con la membrana: unión de los monómeros solubles a la membrana, ensamblaje/oligomerización e incorporación completa del poro en la membrana lipídica52,53. Venetin-1 une monómeros o posiblemente oligómeros solubles a la membrana, pero los otros dos pasos parecen inhibirse de alguna manera.

De acuerdo con el estado actual del conocimiento médico, aún existe la necesidad de desarrollar nuevos fármacos que, solos o en sinergia con otros fármacos, actúen de manera efectiva contra el cáncer de pulmón de células no pequeñas. El cáncer de pulmón es una de las neoplasias con muy mal pronóstico ya que muchas veces se diagnostica demasiado tarde. La base para el tratamiento de la mayoría de los cánceres es la terapia combinada, es decir, el uso de técnicas de cirugía, radioterapia y quimioterapia. El tipo de terapia depende del estadio del tumor y de la eficiencia general del paciente. Durante una enfermedad de cáncer y quimioterapia, una infección por hongos puede desarrollarse en el paciente como una complicación grave. En este caso, es muy importante conocer tanto las actividades de los citostáticos anticancerígenos como sus interacciones con los medicamentos antifúngicos. Los agentes quimioterapéuticos utilizados en oncología con propiedades antifúngicas pertenecen a diferentes grupos de fármacos citostáticos. Estos incluyen antimetabolitos derivados del platino, inhibidores de la topoisomerasa de ADN y moduladores de los receptores de estrógeno. Venetina-1, previamente descrita como una fracción de proteína-polisacárido, mostró una actividad antifúngica eficaz contra C. albicans sin endotoxicidad ni citotoxicidad para las células normales de la piel humana54.

Además de la actividad antitumoral contra las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas A54929,55, la fracción tiene un efecto citotóxico sobre las células de cáncer de colon56,57. Además, se ha demostrado que Venetin-1 activa los macrófagos humanos in vitro y provoca la secreción de citoquinas proinflamatorias (proteínas mensajeras): interleuquina 6 (IL-6) e interleuquina 1β (IL-1β) por parte de estas células. La invención fue patentada por la Oficina de Patentes de Polonia58. Venetin-1 se puede utilizar como componente de una preparación que aumenta la resistencia a las infecciones (p. ej., un fármaco inmunoestimulador) o mejora localmente la respuesta inmunitaria (p. ej., como adyuvante añadido a vacunas bacterianas o virales). Dado que los estudios han demostrado que Venetin-1 exhibe actividad antitumoral directa, el efecto inmunoestimulador mostrado sugiere la posibilidad de usar Venetin-1 en pacientes con cáncer para restaurar el funcionamiento adecuado del sistema inmunológico y combatir el cáncer o para complementar la inmunodeficiencia después de la quimioterapia.

Nuestro equipo de investigación lleva a cabo la búsqueda de un factor activo con actividad antimicrobiana y antitumoral en la lombriz de tierra D. veneta desde hace más de 10 años. En una primera etapa, estos estudios dieron como resultado el aislamiento de la bacteria simbiótica Raoultella ornithinolytica del tracto gastrointestinal de esta especie. Los metabolitos extracelulares de esta bacteria producen compuestos antibacterianos, antifúngicos y anticancerígenos59,60,61,62,63. La separación realizada por métodos cromatográficos es necesaria para aislar el principio activo. Era difícil obtener una cantidad suficiente de la sustancia de prueba y el alto costo de la separación era otra limitación.

El siguiente paso fue intentar aislar el compuesto activo del fluido celómico. Esta etapa de investigación fue exitosa y arrojó una gran cantidad de la sustancia activa con métodos baratos. Se aplicó la separación por diálisis después de la incubación a temperatura elevada para eliminar la citotoxicidad. En este caso, la única limitación es el número de individuos que se pueden ajustar libremente.

El método de adquisición de Venetin-1 es barato, rápido de realizar en cualquier momento y adecuado para uso comercial. Actualmente, hemos obtenido el permiso del comité de bioética para realizar una investigación en un modelo de ratón, y en un futuro cercano se determinará la dosis que estimulará de manera efectiva el sistema inmunológico del animal. El preparado se administrará por vía intraperitoneal mediante inyección, ya que parece ser la mejor manera de evitar la pérdida del preparado y mantener la dosis efectiva. Después de determinar las propiedades inmunomoduladoras, Venetin-1 se inyectará a animales con cáncer de pulmón para determinar el efecto inhibidor.

El efecto anticancerígeno de las nanopartículas activas de D. veneta en las células de cáncer de pulmón A549, confirmado por la presente investigación, puede permitir el uso de un fármaco seguro y eficaz para el cáncer de pulmón. El desarrollo de tal fármaco sería un gran avance en la terapia de esta enfermedad.

Las lombrices de tierra Dendrobaena veneta se cultivaron en condiciones de laboratorio en el Departamento de Inmunobiología de la Universidad Maria Curie-Skłodowska (Lublin, Polonia). Los invertebrados se mantuvieron en recipientes de 3 L llenos de tierra composta a una temperatura de 20 °C en completa oscuridad. Las lombrices fueron alimentadas con vegetales hervidos y hojas de té verde. La dieta se enriqueció con lignina celulosa, necesaria para producir capullos.

Las lombrices adultas se mantuvieron en lignina húmeda durante 24 h para limpiar el intestino. Luego, se recolectó el líquido celómico (FC) de grupos de 10 individuos de lombriz mediante electroestimulación suave (4.5 V). CF se cosechó en NaCl al 0,9 % y se centrifugó a 2500 xg durante 10 min a 4 °C para eliminar los celomocitos. Esto produjo un sobrenadante libre de células, que se esterilizó por filtración a través de filtros Millipore con un tamaño de poro de 0,22 µm. El FC libre de células se incubó durante 10 min a 70 °C para eliminar las propiedades citotóxicas. A continuación, se transfirió a una bolsa de membrana de celulosa con un punto de corte de 12 a 14 kDa. Las muestras se dializaron en agua durante 24 h a 4 °C. Después de la diálisis, se liofilizó Venetin-1. La preparación se almacenó a -20 °C. La concentración de proteína se estimó en las muestras liofilizadas mediante el método de Bradford (Bio-Rad, EE. UU.)64. Se usó líquido celómico no calentado y no dializado (líquido celómico crudo - DVr) para los análisis proteómicos.

Se cultivaron células epiteliales bronquiales humanas (BEAS-2B) y células epiteliales de adenocarcinoma de pulmón (células A549) en placas de cultivo de tejido de poliestireno de 100 mm en medio RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, EE. UU.) que contenía 8 % de FBS (Gibco, Invitrogen, EE. UU.) y penicilina/estreptomicina al 5 % (Gibco, Invitrogen, EE. UU.) en una incubadora humidificada a 37 °C, 5 % de CO2 y 95 % de aire. Las células se sometieron a pases rutinarios mediante tripsinización y se subcultivaron a una densidad de siembra inicial de 2 × 105 durante 72 h. Las células BEAS-2B fueron proporcionadas para la investigación por la Dra. Dorota Ścieglińska del Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center and Institute of Oncology (Gliwice, Polonia). Las células A549 procedían del cultivo celular de la Universidad Médica de Lublin (Polonia).

El ensayo de metil tiazol tetrazolio (MTT) se utilizó para determinar la citotoxicidad de Venetin-1 hacia las células de cáncer de pulmón BEAS-2B y A549. En un primer momento, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 × 104 células/pocillo y se dejaron adherir a 37 °C en una incubadora de CO2 durante 24 h. Al día siguiente, se reemplazó el medio por uno fresco suplementado con varias concentraciones de Venetina-1: 15,6, 31,3, 62,5, 125, 250 y 500 µg/mL. Cada placa de 96 pocillos se preparó con grupos de control (solo células) y de ajuste cero (solo medio). El ensayo se realizó por triplicado. Después de 24, 48 y 72 h, el medio de cultivo se reemplazó por uno nuevo y las células se incubaron con 20 µL de solución de trabajo de MTT (Invitrogen, CA USA) (5 mg/µL) a 37 °C durante 4 h. . A continuación, se eliminó el sobrenadante y se solubilizaron cristales de formazán de color púrpura en 100 μl/pocillo de dimetilsulfóxido (DMSO), seguido de incubación (1 h). La absorbancia de la solución de formazán se midió a 550 nm con un lector de placas Victor 1420 multilabel counter (PerkinElmer, Inc. Waltham, MA USA). El porcentaje de viabilidad celular se calculó utilizando la siguiente fórmula: [Viabilidad celular (%) = (DO del grupo experimental − DO del grupo de ajuste cero)/(OD del grupo de control − DO del grupo de ajuste cero) × 100 %. Proporción de inhibición celular (%) = 1 − viabilidad celular (%)]. Cada experimento fue repetido tres veces.

Para la evaluación de la apoptosis celular, las células A549 se sembraron en placas de microtitulación de 6 pocillos a una densidad de 2 × 105 células/mL y se cultivaron durante 24 h. A continuación, se sustituyó el medio de cultivo por uno nuevo (células control) o se expusieron las células a 125 µg/mL de Venetin-1 durante 72 h. Para determinar el porcentaje de células dentro de la población que experimentaban activamente apoptosis, se utilizó un kit de detección de apoptosis eBioscience™ Annexin V-FITC (Invitrogen, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células recolectadas (~ 5 × 105/mL) se resuspendieron en 200 µL de tampón de unión (1x), y 195 µL de la suspensión celular se mezclaron con 5 µL de Anexina V-FITC luego de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron en 200 µL de tampón de unión (1x), se resuspendieron en 190 µL de tampón de unión (1x) y se tiñeron con 10 µL de yoduro de propidio (PI) (20 µg/mL). Después de 15 minutos de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente, las células se analizaron en un citómetro de flujo Guava easyCyte (Merck, Alemania). Las células se analizaron utilizando el software InCyte™ de Merck Millipore. Se analizaron 10 000 eventos para cada muestra y los resultados se expresaron como porcentaje de células en cada categoría. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes.

La progresión del ciclo celular se determinó usando PI. Las células A549 se prepararon como se describe anteriormente para la evaluación de la apoptosis celular. Después de 72 h, las células se recolectaron, se lavaron con PBS y después de la centrifugación (300 g, 6 min, 4 °C) se fijaron con etanol al 70 % enfriado con hielo a 4 °C durante la noche. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS, se ajustaron a ~ 1 × 106 células y se tiñeron con FxCycle™ PI/RNase Staining Solution (Thermo Fisher, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante (15–30 min a 37 °C) . Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo Guava easyCyte (Merck, Alemania). Se adquirieron 10.000 eventos dentro de esta puerta por muestra.

El estudio involucró cultivos de células BEAS-2B normales y células de cáncer de pulmón A549. Los cultivos se llevaron a cabo en condiciones estándar (37 °C, 5 % de CO2 y 90 % de humedad) tanto sin como con adición de Venetin-1. Se usaron kits humanos CASP ELISA para determinar la concentración de caspasas (FineTest, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd., China). La concentración de caspasa se determinó usando ELISA de acuerdo con el manual del fabricante. Los valores de absorbancia se leyeron a 450 nm utilizando un lector de microplacas (BioRad, EE. UU.).

Las células cancerosas A549, tanto el control como las incubadas con Venetin-1 durante 72 h (a las concentraciones de 62,5 y 125 µg/mL), se tomaron imágenes usando un microscopio Zeiss Axiovert 40CFL (Carl Zeiss, Alemania). Los cambios en su estructura también se documentaron con la función DIC (diferencial de interferencia de contraste). La morfología de las células se visualizó con un aumento de 60x utilizando un microscopio Olympus BX61 (Olympus Corporation, Japón).

Los cambios en la morfología de las células tumorales A549 características de la apoptosis se evaluaron con el uso de microscopía de fluorescencia usando una mezcla de fluorocromo Hoechst 33342 y PI (Sigma, Alemania). Se tomaron imágenes de las células de control y tratadas con Venetin-1 con un microscopio Zeiss LSM 5 Pascal (Carl Zeiss, Alemania) a longitudes de onda de emisión de ~ 460 nm y > 575 nm, respectivamente. La mezcla de tinción a una concentración de 2,5 μl/mL se añadió al cultivo celular y las preparaciones se incubaron durante 5 min a 37 °C en la oscuridad. La apoptosis se evidenció por la fluorescencia azul brillante de los núcleos de células intactas o fragmentadas; las células con núcleos rosados ​​se identificaron como necróticas.

Después de la incubación con Venetin-1, las células A549 de carcinoma de pulmón no pequeño se observaron mediante SEM. Primero, se fijaron con glutaraldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0. Posteriormente, las células se montaron en portaobjetos y se tiñeron con una solución de OsO4 al 1 % durante 1 h, seguido de deshidratación en una serie de soluciones de acetona (15 %, 30 %, 50 %, 70 %, 100 %). Las preparaciones se secaron en un desecador con gel de sílice durante 24 h y se platearon con oro con un recubridor K550X (Quorum Technologies, Reino Unido). Las células fijadas se analizaron utilizando un microscopio electrónico de barrido Tescan Vega 3 (Tescan, República Checa).

La estructura de Venetin-1 se observó y documentó con un microscopio electrónico de barrido Quanta 3D FEG (FEI, Japón). Para las observaciones microscópicas se utilizó una preparación liofilizada, que no había sido sometida a deshidratación estándar ni pulverización catódica con oro. Este procedimiento permitió la visualización de la sustancia activa en su forma natural.

La superficie de las células cancerosas de control y las células tratadas con Venetin-1 se analizó mediante AFM. Las mediciones se realizaron con un microscopio AFM NanoScope V operado en el modo de mapeo nanomecánico cuantitativo PeakForce con MultiMode 8 (Bruker, Veeco Instruments Inc.). Estaba equipado con el software NanoScope 8.15. El módulo de elasticidad local se determinó utilizando el módulo Derjaguin-Muller-Toporov (DMT). La tasa de resorte nominal de la sonda RTESPA (Bruker, EE. UU.) (punta de silicona en una palanca de nitruro) fue de 40 N/m. Se determinó el módulo de Young para un área seleccionada de la superficie de la célula A549. Las muestras se prepararon como se describe para SEM. Se determinó el módulo de Young para 20 campos en cada muestra (áreas oscuras de baja rigidez y áreas brillantes de alta rigidez). Los datos fueron analizados estadísticamente.

La separación de proteínas de Venetina-1 y fluido celómico crudo (DVr) se llevó a cabo con el desarrollo del sistema automático SageElf (Sage Science, Beverly, MA, EE. UU.) en un casete de gel de SDS-Agarosa al 3% (ELP3010). Permite la separación de proteínas en el rango de 10 a 300 kDa. Todas las soluciones necesarias (tampón de carga) y el marcador se suministraron con los casetes en el conjunto. La muestra se disolvió en una solución de carga para obtener una concentración de 200 mg de proteína en 26 ml. Luego, se añadieron a la muestra 4 ml de DTT 0,5 M y toda la mezcla se calentó durante 6 min a 85 °C. Después de enfriar, se añadieron a la muestra 10 ml de la solución de carga con Marker-03 fluorescente y se mezcló la muestra. Las proteínas así preparadas se introdujeron en un casete de SDS-Agarosa al 3%. La separación (modo basado en el tamaño) consistió en la elución automática de proteínas del gel durante 1 h 20 min y luego 30 min. El sistema fue controlado por el software SageElf versión 1.08. Produjo 12 fracciones de la preparación, que luego se digirieron utilizando un procedimiento FASP estándar y tripsina (Trypsin Gold, Promega)27,65. Las fracciones obtenidas de dos corridas se combinaron para un procedimiento FASP. La limpieza final se realizó según el procedimiento Stage Tips66.

El registro del espectro se realizó en un espectrómetro de masas TripleTOF 5600+ (Sciex Framingham, MA, EE. UU.) conectado a un sistema de cromatografía, el sistema Ekspert MicroLC 200 Plus (Eksigent, Redwood City, CA, EE. UU.). Todas las separaciones cromatográficas se realizaron en la columna ChromXP C18CL (3 µm, 120 Å, 150 × 0,3 mm). Para cada muestra, el gradiente cromatográfico para cada ejecución de MS fue del 11 al 42,5 % de B (disolvente A: solución acuosa al 0 %, ácido fórmico al 0,1 %; disolvente B: acetonitrilo al 100 %, ácido fórmico al 0,1 %) durante 60 min. Todo el sistema fue controlado por el software SCIEX Analyst TF 1.7.1. Las mediciones para la biblioteca espectral se adquirieron en el modo de adquisición dependiente de datos (DDA). Cada ciclo del método DDA aplicado comprendía la acumulación de espectros de precursores en 100 ms en el rango de 400–1200 m/z seguido de la acumulación de los 20 espectros de iones de productos precursores principales en 50 ms en el rango de 100–1800 m/z, dando como resultado en un tiempo de ciclo total de 1,15 s. Los iones precursores anteriormente fragmentados se excluyeron dinámicamente.

Se utilizó el software PeaksStudio XPRO (Bioinfor, Canadá) para la búsqueda en la base de datos. La identificación de proteínas se llevó a cabo en base a la base de datos Annelida revisada (04/05/2022, Uniprot) con los siguientes parámetros: carga de filtro 2-8, tolerancia de error para la masa precursora: 25 ppm, tolerancia de iones de fragmentos 0,5, escisión máxima perdida por péptido: tres modificaciones fijas—carbamidometilación, variables—oxidación Met, 1% FDR para péptidos y proteínas. Los análisis finales se realizaron en base al resultado del archivo Spider. Los datos obtenidos fueron depositados en el repositorio Pride67 bajo el identificador.

Para los experimentos de SPR, se prepararon soluciones madre de liposomas de esfingomielina (SM) 3 mM molar y 1-palmitoil-2-deoil-fosfatidilcolina (POPC). La solución de liposomas se preparó como se describió anteriormente68. Brevemente, POPC (Avanti Polar Lipids, EE. UU.) y polvo liofilizado de esfingomielina (huevo de gallina; Avanti Polar Lipids, EE. UU.) se suspendieron en tampón PBS (Sigma Aldrich, EE. UU.). La suspensión de fosfolípidos se sometió a 10 ciclos de incubación de 30 min de incubación en un baño de ultrasonidos con calentamiento (333 K) y 30 min de incubación a 277 K. A continuación, se realizó la extrusión con un Avanti Mini Extruder (Avanti Polar Lipids, EE. UU.) con una membrana de poro de 0,1 µm. Este procedimiento, es decir, pasar la solución lipídica a través de la extrusora, se repitió once veces. Después de completar el procedimiento de extrusión, la muestra estaba lista para usar.

La unión de los lípidos de esfingomielina (SM) y 1-palmitoil-2-deoil-fosfatidilcolina (POPC) se realizó en el sensor L1 (Cytiva, EE. UU.) utilizando el instrumento Biacore T200 (Cytiva, EE. UU.). La interacción de las proteínas se analizó después de la inmovilización de los lípidos (SM o POPC) en la superficie del chip sensor L1 como se describe en el manual del fabricante. SM se inmovilizó al nivel de respuesta de 3659,96 RU (± 415,45 RU), y POPC se inmovilizó al nivel de respuesta de 4995,67 RU (± 570,47 RU). Luego, después de bloquear el sensor con una solución de albúmina de 0,5 mg/ml, se empleó el protocolo estándar del fabricante "Inyección y recuperación". Los extractos de proteínas se corrieron sobre la superficie del chip sensor con lípidos inmovilizados que permitían la unión a proteínas. A continuación, después de 30 s de incubación con TFA al 0,5 %, las proteínas unidas se recuperaron en 50 µl de NH4HCO3 50 mM. Luego, las muestras recuperadas de al menos dos celdas de flujo se analizaron con MS. Después de todos los análisis, el espectro de respuesta de referencia de fondo se sustrajo del espectro de respuesta experimental y los resultados se presentaron en sensogramas.

Las fracciones recolectadas del experimento SPR que contenían proteínas unidas a los lípidos probados se sometieron a digestión clásica en una solución. Antes de la adición de tripsina, las muestras se trataron con una solución de DTT 50 mM (45 min, 56 °C), seguido de IAA (45 min en la oscuridad). La digestión con tripsina se llevó a cabo durante la noche a 37 °C. Cuando se detuvo la digestión bajando el pH de la solución (1% de ácido fórmico en agua), las muestras se purificaron con StageTips y se concentraron a 30 ml. El análisis LC-MS/MS y la identificación de proteínas se realizaron de manera análoga como en el caso de las muestras de Venetin-1.

La solución de Venetin-1 con una concentración de proteína de 1 mg/mL se colocó en una cámara ultrasónica (Pol-Sonic, Polonia) durante 10 min a 40 °C. Luego, la suspensión acuosa se vitrificó en una malla TEM con una película de carbón perforada (Quantifoil R 2/2; Quantifoil Micro Tools GmbH, Großlöbichau, Alemania). La malla se activó previamente durante 15 s en plasma de oxígeno utilizando un dispositivo Femto (Diener Electronic, Ebhausen, Alemania). Se aplicó una muestra de 3 µL a la malla. Posteriormente, se realizó la transferencia con papel de filtro y la congelación instantánea en etano líquido utilizando un soplador Vitrobot Mark IV (FEI Company, Hillsboro, Oregón, EE. UU.). Las muestras glaseadas se mantuvieron en nitrógeno líquido hasta colocarlas en un soporte Cryo-TEM Gatan 626 (Gatan Inc., Pleasanton, EE. UU.). Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryo-TEM) se obtuvieron utilizando un microscopio Tecnai F20 X TWIN (FEI Company, Hillsboro, Oregón, EE. UU.) equipado con un cañón de emisión de campo (FEG) que opera a un voltaje de aceleración de 200 kV. Se utilizó una cámara Eagle 4k HS (FEI Company, EE. UU.) para la captura de imágenes y el software TIA (FEI Company, EE. UU.) para el procesamiento.

Los estudios químicos de Venetin-1 se realizaron utilizando el método de espectroscopia electrónica XPS. Los análisis se realizaron en el sistema analítico multicámara Prevac UHV (Prevac, Polonia). Después de montarlas en el soporte de molibdeno, las muestras de Venetin 1 probadas se desgasificaron a temperatura ambiente a un alto vacío constante de ~ 5 × 10–8 mbar en la esclusa de carga del sistema UHV. El análisis XPS se realizó después de introducir la muestra en la cámara analítica del sistema UHV. Una fuente de radiación monocromática AlKα sirvió como fuente de excitación de fotoelectrones. Los fotoelectrones fueron excitados por radiación de rayos X con línea característica AlKα y energía de 1486.7 eV generada por una lámpara VG Scienta SAX 100 con ánodo de aluminio junto con un monocromador VG Scienta XM 780.

Los espectros de la encuesta se realizaron en una amplia gama de energías de enlace, utilizando los siguientes parámetros del analizador: modo de operación: barrido, energía de transición de 200 eV, rango medido de energía de enlace de fotoelectrones de 0 a 1200 eV, paso de medición de 0,5 eV, tiempo de recolección en un solo paso: 0,2 s, número de iteraciones: 4.

Después de realizar el estudio del espectro, también se hicieron los espectros en un rango estrecho de energías de enlace para carbono, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre. Las pruebas se realizaron con los siguientes parámetros del analizador: modo de operación: barrido, energía de transición de 50 eV, paso de medición: 0,1 eV, tiempo de recolección en un solo paso: 0,667 s.

Para los cálculos cuantitativos, los espectros obtenidos se procesaron con el software Casa XPS. Los ejes X correspondientes a la energía de enlace se calibraron utilizando el pico de carbono alifático C1s. Se supuso que la energía de enlace correspondiente a este pico era EB = 285,0 eV.

Para caracterizar el tamaño de las micropartículas de Venetin-1, realizamos un experimento DLS utilizando el instrumento Prometheus Panta (NanoTemper Technologies GmbH, Alemania). Las muestras se cargaron en ocho capilares que actuaban como réplicas donde el análisis paralelo reveló la homogeneidad de las micropartículas.

Los datos obtenidos de los análisis proteómicos se han depositado en el repositorio PRIDE y están disponibles con el número de acceso PXD034132.

Bade, BC & Dela, CCS Cáncer de pulmón 2020: epidemiología, etiología y prevención. clin. Pecho Med. 41. https://doi.org/10.1016/j.ccm.2019.10.001 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Herbst, R., Morgensztern, D. & Boshoff, C. Biología y manejo del cáncer de pulmón de células no pequeñas. Naturaleza 553, 446–454 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Hecht, SS Tabaquismo y cáncer de pulmón: Mecanismos químicos y enfoques para la prevención. Lanceta Oncol. 8, 461–469 (2002).

Artículo Google Académico

Akopyan, G. & Bonavida, B. Comprensión del carcinógeno NNK del humo del tabaco y la tumorigénesis pulmonar (Revisión). En t. J. Oncol. 29, 745–752 (2006).

CAS PubMed Google Académico

Barta, JA, Powell, CA & Wisnivesky, JP Epidemiología global del cáncer de pulmón. Ana. globo Salud https://doi.org/10.5334/aogh.2419 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Raaschou-Nielsen, O. et al. Contaminación del aire e incidencia de cáncer de pulmón en 17 cohortes europeas: análisis prospectivos del Estudio europeo de cohortes sobre los efectos de la contaminación del aire (ESCAPE). Lanceta Oncol. 14, 813–822 (2013).

Artículo PubMed Google Académico

Sol, S. et al. Importancia pronóstica de la expresión del ARNm de los genes ERCC1, RRM1, TUBB3 y TYMS en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas. Exp. El r. Medicina. 10, 937–941 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gridelli, C. et al. Cáncer de pulmón de células no pequeñas. Nat. Dis. rev. Primers 21, 15009. https://doi.org/10.1038/nrdp.2015.9 (2015).

Artículo Google Académico

Travis, WD Avances en tumores neuroendocrinos de pulmón. Ana. oncol. 21, 65–71 (2010).

Artículo Google Académico

Magesh, V. et al. Ocimum sanctum induce la apoptosis en células de cáncer de pulmón A549 y suprime el crecimiento in vivo de células de carcinoma de pulmón de Lewis. fitotera. Res. 23, 1385–1391 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lee, SH, Jaganath, IB, Wang, SM y Sekaran, SD Efectos antimetastásicos de Phyllanthus en líneas celulares de cáncer de pulmón humano (A549) y mama (MCF-7). PLoS ONE 6, e20994. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020994 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramalakshmi, P., Subramanian, N., Saravanan, R., Mohanakrishnan, H. y Muthu, M. Efecto anticancerígeno de Coleus ambionicus (Karpooravalli) en la línea celular de cáncer de pulmón humano (A549). En t. J. Dev. 4, 2442–2449 (2014).

Google Académico

Wei-Sheng, C. et al. La bostricina inhibe la proliferación de células A549 de carcinoma de pulmón humano a través de la regulación a la baja de la vía PI3K/Akt. Exp. J. clin. Cáncer Res. https://doi.org/10.1186/1756-9966-30-17 (2011).

Artículo Google Académico

Hsiao, CJ et al. La picnidiona, un agente derivado de hongos, induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en células de cáncer de pulmón humano A549. química Biol. Interactuar. 197, 23–30 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wong, KL y col. Proteínas y péptidos bioactivos aislados de medicamentos chinos con potencial farmacéutico. Mentón. Medicina. https://doi.org/10.1186/1749-8546-9-19 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Arulvasu, C. et al. Evaluación del efecto antiproliferativo de la emulsión de aceite de sardina en las líneas celulares de cáncer A549 y HCT 15. En t. J. PharmtechRes. 2, 1171–1177 (2010).

CAS Google Académico

Hua, Z., Wang, YH, Cao, HW, Pu, LJ & Cui, YD Purificación de una proteína del fluido celómico de la lombriz de tierra Eisenia foetida y evaluación de sus actividades hemolíticas, antibacterianas y antitumorales. Farmacia Biol. 49, 269–275 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Vasanthi, K., Presidente, K. y Ranjit Singh, AJA Actividad antimicrobiana de la pasta de lombrices de tierra (Eudrilus eugeniae). Afr. J. Medio Ambiente. ciencia Tecnología 7, 789–793 (2013).

Artículo Google Académico

Verma, YK & Verma, MK Earthworm: una fuente potencial de compuestos antimicrobianos estables y potentes: estudio de aislamiento y purificación. En t. J. Pharm. Farmacia ciencia 4, 540–543 (2012).

Google Académico

Bhorgin, AJ & Uma, K. Actividad antimicrobiana del polvo de lombriz de tierra (Lampito mauritii). En t. J. Curr. Microbiol. aplicación. ciencia 3, 437–443 (2014).

Google Académico

Sethulakshmi, KC, Ranilakshmi, KC & Thomas, AP Potencialidades antibacterianas y antifúngicas de la pasta de lombrices de tierra Eudrilus eugeniae y el fluido celómico. AJOB 5, 1–7 (2018).

Google Académico

Ansari, AA & Sitaram, K. Una investigación sobre las propiedades antimicrobianas y antifúngicas del polvo de lombriz obtenido de Eisenia fetida. Soy. J. Tecnología de Alimentos. 6, 329–335 (2011).

Artículo Google Académico

Mathur, A. et al. Actividad antimicrobiana de extractos de lombrices. química Farmacia Res. 2, 364–370 (2010).

Google Académico

Rajesh, C., Rajamanikkam, K., Nadana, G., Vadivu, R. & Palanichelvam, K. El fluido celómico de lombriz de tierra, Eudrilus eugeniae inhibe el crecimiento de hifas fúngicas, in vitro. IJEAT 9, 792–796 (2019).

Artículo Google Académico

Arslan-Aydoğdu, EO & Çotuk, A. Actividad antibacteriana y hemolítica del fluido celómico de Dendrobaena veneta (Oligochaeta, Lumbricidae) que vive en diferentes localidades. IUFS J. Biol. 67, 23–32 (2008).

Google Académico

Chauhan, PS, Tomar, J., Prasad, GBKS y Agrawal, OP Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de tejido de lombriz de Eudrilus eugeniae. J. Chem. Farmacia Res. 6, 28–38 (2014).

Google Académico

Fiołka, MJ et al. Cambios metabólicos, estructurales y proteómicos en células de Candida albicans inducidos por la fracción proteína-carbohidrato del líquido celómico de Dendrobaena veneta. ciencia Rep. 11, 16711. https://doi.org/10.1038/s41598-021-96093-1 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fiołka, MJ et al. La pared celular de Candida albicans como blanco de acción de la fracción proteína-carbohidrato del líquido celómico de Dendrobaena veneta. ciencia Rep. 10, 16352. https://doi.org/10.1038/s41598-020-73044-w (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fiołka, MJ et al. Actividad antitumoral y acción apoptótica del fluido celómico de la lombriz de tierra Dendrobaena veneta contra células de cáncer de pulmón humano A549. APMIS 127, 435–448 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Fiołka, MJ et al. Efecto anti-Candida albicans de la fracción de fluido celómico obtenida de la lombriz de tierra Dendrobaena veneta. PLoS ONE 14, e0212869. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0212869 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koinuma, M. et al. Análisis de óxidos de grafeno reducidos por espectroscopía de fotoelectrones de rayos X y capacitancia electroquímica. química Letón. 42, 924–926 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Rabchinski, MK et al. Del óxido de grafeno al grafeno aminado: Síntesis fácil, su estructura y propiedades electrónicas. ciencia Rep. 10, 6902. https://doi.org/10.1038/s41598-020-63935-3 (2020).

Artículo ADS CAS Google Académico

Radaelli, G. et al. Recubrimientos antiadhesivos de alta eficacia a partir de copolímeros acrílicos perfluorados dispersos en agua con pH modificado: el caso de la vulcanización del caucho. Adv. Mate. Interfaces. https://doi.org/10.1002/admi.201600069 (2016).

Artículo Google Académico

Raicopol, M., Andronescu, C., Atasiei, R., Hanganu, A. y Pilan, L. Funcionalización electroquímica posterior a la polimerización de un polímero conductor: electrorreducción de sal de diazonio en electrodos de polipirrol. J. Electroquímica. Soc. 161, 103–113 (2014).

Artículo Google Académico

Larciprete, R., Gardonio, S., Petaccia, L. & Lizzit, S. Funcionalización con oxígeno atómico de nanotubos C de doble pared. Carbono 47, 2579–2589 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Wagstaffe, M. et al. Una investigación experimental de la adsorción de un ácido fosfónico en la superficie de la anatasa TiO2(101). J. física. química 120, 1693-1700 (2016).

CAS Google Académico

Cooper, EL et al. Earthworms dilong: los modelos antiguos, económicos y no controvertidos pueden ayudar a aclarar los enfoques de la medicina integrada que enfatizan los sistemas neuroinmunes. evidente Complemento basado. Alternativo Medicina. 2012, 164152. https://doi.org/10.1155/2012/164152 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lee, YC et al. Efectos inhibidores de andrographolide sobre la migración y la invasión en células A549 de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas a través de la regulación negativa de la vía de señalización PI3K/Akt. EUR. J. Pharmacol. 632, 23–32 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mollah, ML et al. Actividad anticancerígena y efectos apoptóticos de Bulnesia sarmienti contra células H460 de cáncer de pulmón humano. oncol. Res. 18, 259–267 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Harikumar, KB, Kuttan, G. & Kuttan, R. Phyllanthus amarus inhibe el crecimiento celular e induce la apoptosis en las células de ascitis del linfoma de Dalton a través de la activación de la caspasa-3 y la regulación a la baja de Bcl-2. Integrar Cáncer Ther. 8, 190–194 (2009).

Artículo PubMed Google Académico

Yang, HL et al. Hseu Inhibición del crecimiento e inducción de apoptosis en células de cáncer de mama MCF-7 por Antrodia camphorata. Cáncer Lett. 231, 215–227 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Glinsky, GV, Glinsky, VV, Ivanova, AB & Hueser, CJ Apoptosis y metástasis: el aumento de la resistencia a la apoptosis de las células cancerosas metastásicas se asocia con la profunda deficiencia de los mecanismos de ejecución de la apoptosis. Cáncer Lett. 115, 185–193 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Berger, T., Mak, TW & McIlwain, DR Funciones de la caspasa en la muerte celular y la enfermedad. Harb de primavera fría. Perspectiva. Biol. 5, a008656. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a008656 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dawar, S., Dorstyn, L., Kumar, S. & Shalini, S. Funciones antiguas, nuevas y emergentes de las caspasas. La muerte celular difiere. 22, 526–539 (2015).

Artículo PubMed Google Académico

Lamkanfi, M. & Van Opdenbosch, N. Caspases en muerte celular, inflamación y enfermedad. Inmunidad 50, 1352–1364.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Freel, CD, Kornbluth, S. & Parrish, AB Mecanismos celulares que controlan la activación y función de la caspasa. Harb de primavera fría. Perspectiva. Biol. 5, a008672. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a008672 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramirez, MLG & Salvesen, GS Introducción a los mecanismos de las caspasas. Semin. Celúla. desarrollo Biol. 82, 79–85 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Green, DR & Llambi, F. Señalización de muerte celular. Harb de primavera fría. Perspectiva. Biol. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a006080 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Nikolaev, NI, Müller, T., Williams, DJ y Liu, Y. Cambios en la rigidez de las células madre mesenquimales humanas con el progreso de la muerte celular medido por microscopía de fuerza atómica. J. Biomech. 47, 625–630 (2014).

Artículo PubMed Google Académico

Kobayashi, H., Ohta, N. & Umeda, M. Biología de la lisenina, una proteína en el fluido celómico de la lombriz de tierra Eisenia foetida. En t. Rev. Cytol. 236, 45–99 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kiyokawa, E. et al. Reconocimiento de esfingomielina por lisenina y proteínas relacionadas con la lisenina. Bioquímica 43, 9766–9773 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kulma, M. & Anderluh, G. Más allá de la formación de poros: reorganización de la membrana plasmática inducida por proteínas formadoras de poros. Celúla. mol. Ciencias de la vida 78, 6229–6249 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sukumwang, N. & Umezawa, K. Lisenina de toxina formadora de poros derivada de lombrices de tierra y detección de sus inhibidores. Toxinas 5, 1392–1401 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Patente No 234801 La fracción de alto peso molecular del fluido celómico del gusano Dendrobaena veneta para el tratamiento de micosis causadas por Candida albicans (2020).

Patente No 237653. La fracción proteína-carbohidrato del fluido celómico de la lombriz de tierra Dendrobaena veneta para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón (2021).

Patente No 236228. La fracción proteína-carbohidrato de alto peso molecular aislada del fluido celómico de la lombriz de tierra Dendrobaena veneta para su uso en el tratamiento del cáncer de colon (2021).

Czerwonka, A. et al. Acción pro-apoptótica de la fracción proteína-carbohidrato aislada del fluido celómico de la lombriz de tierra Dendrobaena veneta contra células de adenocarcinoma de colon humano. biomedicina Farmacéutico. 126, 110035. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2020.110035 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Patente P.429033. Fracción de proteína-azúcar aislada del líquido celómico de Dendrobaena veneta para uso en inmunoterapia no específica (2021). (número de patente pendiente).

Fiołka, MJ, Zagaja, MP, Piersiak, TD, Wróbel, M. & Pawelec, J. La bacteria intestinal de Dendrobaena veneta (Annelida: Oligochaeta) posee actividad antimicobacteriana. J. Invertebrados. Patol. 105, 63–73 (2010).

Artículo PubMed Google Académico

Fiołka, MJ et al. Acción anti-Candida albicans del complejo glicoproteico purificado a partir de metabolitos de la bacteria intestinal Raoultella ornithinolytica aislada de lombrices de tierra Dendrobaena veneta. Aplicación J. Microbiol. 113, 1106–1119 (2012).

Artículo PubMed Google Académico

Fiołka, MJ et al. Efectos antifúngicos y anticancerígenos de un complejo polisacárido-proteína de la bacteria intestinal Raoultella ornithinolytica aislada de la lombriz de tierra Dendrobaena veneta. Pato. Dis. 69, 49–61 (2013).

Google Académico

Fiołka, MJ et al. Efectos antitumorales y apoptóticos de un nuevo complejo Tris-péptido obtenido tras el aislamiento de metabolitos extracelulares de Raoultella ornithinolytica. Aplicación J. Microbiol. 118, 1357–1369 (2015).

Artículo PubMed Google Académico

Fiołka, MJ et al. Acción antimicobacteriana de un nuevo complejo glicolípido-péptido obtenido a partir de metabolitos extracelulares de Raoultella ornithinolytica. APMIS 123, 1069–1080 (2015).

Artículo PubMed Google Académico

Bradford, MM Un método rápido y sensible para la cuantificación de cantidades de microgramos de proteína utilizando el principio de unión proteína-colorante. Anal. Bioquímica 72, 248–254 (1976).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wiśniewski, JR Evaluación cuantitativa de los protocolos FASP de preparación de muestras asistida por filtro (FASP) y digestión multienzimática. Anal. química 88, 5438–5443 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

Rappsilber, J., Mann, M. & Ishihama, Y. Protocolo para micropurificación, enriquecimiento, fraccionamiento previo y almacenamiento de péptidos para proteómica usando StageTips. Nat. Protocolo 2, 1896-1906 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Base de datos PRIDE y herramientas y recursos relacionados en 2019: mejora del soporte para datos de cuantificación Nucleic Acids Research Oxford Academic (consultado el 30 de abril de 2021). https://academic.oup.com/nar/article/47/D1/D442/5160986 (2019).

Jurczak, P. et al. Bicapa de fosfolípidos de DMPC como una interfaz potencial para la oligomerización de cistatina C humana: análisis de interacciones proteína-liposoma mediante espectroscopia de RMN. Membranas 11, 13. https://doi.org/10.3390/membrane11010013 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

El análisis químico del compuesto activo fue apoyado por el Proyecto del Centro Nacional de Ciencias de Polonia [2020/37/B/NZ7/00763]. Nos gustaría agradecer a la Dra. Dorota Ścieglińska del Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center and Institute of Oncology (Gliwice, Polonia) por proporcionar las células BEAS-2B.

Facultad Intercolegial de Biotecnología de la Universidad de Gdańsk y la Universidad de Medicina de Gdańsk, Gdańsk, Polonia

Magda Rybicka, Paulina Czaplewska, Katarzyna Węgrzyn, Agata Szpiech y Natalia Musiał

Departamento de Biología y Genética, Universidad Médica de Lublin, Lublin, Polonia

Jolanta Rzymowska

Laboratorio analítico, Instituto de Ciencias Químicas, Facultad de Química, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Weronika Sofińska-Chmiel

Departamento de Inmunobiología, Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Sylwia Wójcik-Mieszawska y Marta J. Fiołka

Departamento de Biología Celular, Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Kinga Lewtak

Facultad de Química, Universidad de Gdańsk, Gdańsk, Polonia

Przemyslaw Jurczak

Centro de Biotecnología de Malopolska, Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia

Jakub Nowak

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MF obtuvo el complejo activo de Venetin-1, realizó análisis Cryo-TEM y SEM, preparaciones de AFM, análisis de apoptosis (Fig. 5), coordinación de la investigación y redacción del texto principal del manuscrito; SWM escribió la introducción e hizo las Figs. 7, 4 y el análisis estadístico; JR realizó análisis de caspasa y microscopía óptica de células cancerosas (Fig. 55 a); KL hizo la Fig. 4 y la Fig. 6 y la literatura; análisis de citometría de flujo realizado por RM; PC análisis de resultados, preparación de medidas SPR, preparación del manuscrito; KW realizó mediciones de SPR y compilación de datos de SPR; PJ hizo preparación de liposomas; AS y NM realizaron la separación SageElf, la digestión FASP, la preparación y el análisis del método LC-MS/MS, WSC realizó el análisis XPS, JN preparó el análisis Pantha.

Correspondencia a Paulina Czaplewska o Marta J. Fiołka.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Rybicka, M., Czaplewska, P., Rzymowska, J. et al. Nueva nanopartícula de Venetina-1 del fluido celómico de lombrices de tierra como agente prometedor para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas. Informe científico 12, 18497 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

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Recibido: 17 mayo 2022

Aceptado: 29 de septiembre de 2022

Publicado: 02 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

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