Las microcápsulas de gel de agarosa permiten una fácil

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 17014 (2022) Citar este artículo

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Se desarrolló un nuevo tipo de microcápsula de gel de agarosa (AGM), que consiste en un núcleo de sol de picolitro de alginato y una cubierta de gel de agarosa, para obtener ADN genómico amplificado de bacterias de una sola célula de alta calidad. El AGM es fácil de preparar en una emulsión estable con aceite de densidad equivalente al agua, lo que evita la agregación de AGM, solo con equipo de laboratorio estándar. Células individuales de un cultivo puro de Escherichia coli, una comunidad simulada que comprende 15 cepas de bacterias intestinales humanas y una comunidad bacteriana intestinal de termitas se encapsularon dentro de AGM, y sus muestras de ADN genómico se prepararon con amplificaciones paralelas masivas en un tubo. La secuenciación del genoma no necesitó una segunda ronda de amplificación y mostró una integridad genómica promedio mucho más alta que la obtenida usando un método de amplificación convencional en la escala de microlitros, independientemente del contenido genómico de guanina-citosina. Nuestro novedoso método que utiliza AGM permitirá a muchos investigadores realizar genómica unicelular de manera fácil y efectiva, y puede acelerar el análisis genómico de microorganismos aún no cultivados.

Los microorganismos se distribuyen ubicuamente en diversos ambientes. A menudo se asocian con otros organismos y juegan un papel importante en los ecosistemas. Sin embargo, la mayoría de las especies microbianas son difíciles de cultivar con métodos convencionales y se denominan microorganismos aún no cultivados1. En las últimas dos décadas, se han estudiado ampliamente utilizando métodos independientes del cultivo, como el análisis de secuenciación de amplicón de genes de ARN ribosomal de subunidades pequeñas (SSU rRNA) y el análisis de secuenciación de metagenomas. La metagenómica es una poderosa herramienta para investigar las funciones ecológicas y fisiológicas de la microbiota en función de sus repertorios genéticos codificados. El desarrollo reciente del agrupamiento computacional de fragmentos metagenómicos en conjuntos taxonómicos microbianos respectivos ha reforzado la utilidad de la metagenómica2,3. Sin embargo, el agrupamiento computacional basado en la composición de secuencias, la homología con las secuencias de la base de datos y la cobertura de lectura de secuencias de cada fragmento a menudo puede fallar en discriminar genomas de (sub)especies estrechamente relacionadas y clasificar correctamente regiones genómicas que exhiben características distintas de otras, como el ARNr. genes, profagos y plásmidos4,5. Además, se requiere un esfuerzo de secuenciación masivo para obtener las secuencias del genoma de especies menores en la comunidad microbiana3.

La genómica unicelular, en la que el ADN genómico completo se amplifica a partir de células individuales físicamente aisladas6, se ha utilizado como método alternativo o complementario para revelar la capacidad metabólica de microorganismos aún no cultivados1,7. El aislamiento de una sola célula se puede lograr en muchos casos mediante el uso de tecnologías como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)1, micromanipuladores8, dispositivos microfluídicos9,10 y encapsulación en gotas de agua en aceite11. Aunque se han desarrollado varios métodos para la amplificación del genoma completo12, la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) que usa la ADN polimerasa phi29 con cebadores aleatorios es la más utilizada debido a su relativa simplicidad, confiabilidad y aplicabilidad6,13. Sin embargo, la MDA demuestra inherentemente un sesgo de amplificación extremo entre las regiones del genoma1, que ha sido la principal limitación técnica en la genómica unicelular. Además, el alto contenido de guanina-citosina (GC) del ADN genómico tiende a aumentar el sesgo de amplificación1,14. El sesgo de amplificación se puede suprimir utilizando recipientes de reacción pequeños; por ejemplo, cámaras de microcanales (60 nL)10, micropocillos de nanolitros (12 nL)15, microfluidos virtuales (MDA en una lámina de gel, 60 nL)16, gotitas digitales generadas mediante el uso de un microcanal (9,5–240 pL)17,18, 19 y perlas de gel20. Sin embargo, estas técnicas de microfabricación no están disponibles para muchos microbiólogos, y la cantidad del producto de amplificación suele ser demasiado pequeña para la secuenciación directa del genoma; por lo tanto, a menudo se requiere una segunda ronda de MDA, lo que finalmente mejora el sesgo de amplificación21.

Una microcápsula22 de hidrogel de núcleo hueco, que consta de una cubierta de hidrogel y un núcleo de sol, tiene potencial como recipiente eficaz para MDA unicelular. Se ha informado que muchas microcápsulas de hidrogel de núcleo hueco son útiles para el cultivo celular y el trasplante celular23,24,25. Sin embargo, el producto MDA del ADN genómico de una sola célula amplificado en un núcleo hueco a escala de picolitros en una microcápsula no se ha evaluado completamente para la genómica de una sola célula.

Aquí, presentamos un nuevo método de genómica de una sola célula que utiliza un AGM que consiste en una cubierta de gel de agarosa y un núcleo hueco de sol de alginato, que permite el aislamiento de una sola célula y MDA a escala de picolitros (Fig. 1a). La fabricación de AGM se optimizó aquí para facilitar la preparación utilizando equipos y reactivos económicos, como un mezclador vórtex, centrífugas y reactivos disponibles comercialmente (Fig. 1b), aunque se sacrifica la uniformidad del tamaño de AGM en comparación con los métodos que utilizan técnicas de microfabricación26,27 . Por lo tanto, este AGM se puede preparar fácilmente y es escalable para muchos microbiólogos. Mediante el uso de AGM, se puede encapsular una sola célula bacteriana en su núcleo de sol a escala de picolitros y luego someterla a MDA simplemente intercambiando soluciones (designadas aquí como 'MDA-in-AGM'). Demostramos, utilizando E. coli, una mezcla simulada de bacterias intestinales humanas y la microbiota intestinal de termitas, que MDA-in-AGM permite una genómica unicelular masivamente paralela con una integridad del genoma mucho mejor en comparación con un método convencional que utiliza FACS y microlitros. escala MDA (FACS-MDA).

Vista esquemática de una microcápsula de gel de agarosa (AGM) y su proceso de preparación. ( a ) Diagrama esquemático del AGM desarrollado en este estudio para el aislamiento de una sola célula y la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA). El AGM consta de una cubierta de hidrogel de agarosa y un núcleo de sol de alginato. El núcleo de alginato proporciona una cámara de reacción a escala de picolitros para MDA, mientras que la cubierta de agarosa actúa como una envoltura permeable para enzimas y moléculas pequeñas y como una pared protectora contra partículas y moléculas más grandes, como células bacterianas y ADN genómico/amplificado. (b) Esquema de preparación para AGM que contienen células de Escherichia coli. Los núcleos de alginato y las cubiertas de agarosa se gelifican con Ca2+ a partir de CaCO3 y se enfrían en una emulsión, respectivamente. El poligliceril-6 octacaprilato (PGO) puede suprimir la agregación de AGM durante la gelificación de agarosa mediante enfriamiento. Finalmente, los núcleos de gel de alginato se aíslan con EDTA quelando Ca2+. Alcohol isoestearílico ISA.

Para los núcleos de AGM, se prepararon perlas de gel de alginato que contenían células bacterianas utilizando el método de emulsificación/gelificación interna27 (Fig. 1b). Brevemente, una mezcla de solución de alginato, células bacterianas y nanopartículas de CaCO3 se emulsionó con alcohol isoestearílico (ISA). Las microgotas resultantes se gelificaron con iones de calcio que se liberaron de las nanopartículas de CaCO3 mediante la adición de ácido acético a la emulsión de agua en aceite. La concentración de células bacterianas se optimizó utilizando diluciones en serie para que una microgota de alginato contuviera una o ninguna célula bacteriana. Los núcleos de gel de alginato resultantes se lavaron secuencialmente con éter dietílico, 1-butanol y tampón Tris-HCl (pH 7,5).

Luego se añadió solución de agarosa (SeaPlaque, Lonza; concentración final 2%) a los núcleos de gel de alginato suspendidos en Tris-HCl (pH 7,5) a 35 °C, y la mezcla se emulsionó con Span 85 al 0,25% (v/v) en poligliceril-6 octacaprilato (PGO) a 35 ° C (Fig. 1b). Aquí se usó PGO porque su densidad es equivalente al agua (0,997 g/mL) y, por lo tanto, PGO emulsionó agua de manera estable (Fig. S1a complementaria), evitó la agregación del gel de agarosa (S1b) y aumentó los diámetros (S1c y S1d) y los rendimientos (S1e) de gotas de gel de agarosa. Las gotas de agarosa se gelificaron gradualmente en la emulsión estable enfriándolas a 4 °C. Después de eliminar el PGO mezclándolo con éter dietílico y luego con 1-butanol, los núcleos de gel de alginato se aislaron con una décima parte del volumen de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M. La solación de los núcleos de alginato se verificó marcando los núcleos de alginato con rodamina 123 y observando la difusión del colorante en el tampón al fundir las cubiertas de gel de agarosa en presencia de EDTA, mientras que los núcleos de alginato permanecieron en forma de gel con CaCl2 50 mM (Suplementario Figura S2). El núcleo de sol de alginato proporciona un espacio apropiado para la reacción de MDA, que se demostró por los rendimientos mucho mayores de ADN amplificado que en las reacciones con un núcleo de gel de alginato o perlas de gel de agarosa como se describe a continuación. Los AGM se lavaron con tampón Tris-EDTA (TE) (pH 7,4) para eliminar el exceso de EDTA, se suspendieron en medio volumen de tampón TE y se almacenaron a 4 °C. Todo el proceso de preparación de AGM se puede realizar en 7 h.

Se utilizó Escherichia coli DH5α como microorganismo modelo. Se agregaron células de E. coli a una concentración de 3 × 106 células mL−1 a una solución de alginato-CaCO3 y se encapsularon en 5,64 ± 1,72 × 105 AGM (media ± DE) en tres experimentos independientes, que correspondieron a 12,5% ± 5,4% del total de juntas generales. De los AGM que contenían células de E. coli, aproximadamente el 94 % albergaba una sola célula en el núcleo (Tabla complementaria S1). En los tres experimentos independientes, los diámetros de los AGM preparados fueron 39,6 ± 22,2 µm, 51,4 ± 13,3 µm y 49,3 ± 19,6 µm (Fig. S3a complementaria). Los diámetros de AGM y los volúmenes del núcleo mostraron distribuciones normales y distribuciones logarítmicas normales, respectivamente (Figuras complementarias S3b, S4). El volumen central medio de AGM en los tres experimentos fue de 15,1 ± 6,3 pL (n = 3).

Los AGM (en 50 µL de suspensión) se lavaron con agua estéril y se recogieron por centrifugación. La lisis de las células bacterianas y la desnaturalización del ADN bicatenario dentro de los AGM se realizaron a temperatura ambiente durante 30 min con 50 µL de una solución alcalina, que fue el Buffer D2 del REPLI-g UltraFast Mini Kit (Qiagen). La desnaturalización se detuvo por neutralización con la adición de un volumen igual de solución de parada del kit y luego se eliminó el sobrenadante por centrifugación. Se añadió tampón de reacción (93,5 µL) que contenía 11 µL de ADN polimerasa REPLI-g UltraFast del kit y la mezcla resultante se incubó a 30 °C durante 3 h. La reacción se detuvo con una décima parte del volumen de EDTA 0,5 M y los AGM se lavaron tres veces con 200 µl de tampón TE. Todos los reactivos utilizados en la preparación de MDA y AGM se irradiaron con luz ultravioleta para degradar cualquier ADN contaminante antes de su uso.

Entre los 4,6 ± 2,9 × 105 AGM preparados con células de E. coli, el 8,9 % ± 0,8 % mostró amplificación de ADN, lo que correspondió al 77,0 % ± 27,2 % de los AGM que contenían células de E. coli (n = 3) (Tabla complementaria S1) . Como se muestra en la Fig. 2, el ADN amplificado llenó el núcleo de sol de alginato, mientras que los AGM con núcleos de gel de alginato que se prepararon sin el paso de solación con EDTA o perlas de gel de agarosa que no contenían núcleo de alginato exhibieron solo una amplificación de ADN limitada o nula por MDA.

Mejora del rendimiento de la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) mediante la solación del núcleo de alginato. Se evaluó el efecto de la solación del núcleo de alginato sobre la productividad de MDA dentro de microcápsulas de gel de agarosa (AGM). El ADN genómico de Escherichia coli encapsulado dentro de AGM se amplificó mediante MDA con o sin solación de alginato utilizando EDTA. El ADN amplificado se detectó con SYBR Green I. Se superponen una imagen de contraste de fase (rojo) y una imagen epifluorescente (verde, SYBR Green I). También se llevó a cabo como experimento de control MDA en perlas de gel de agarosa (sin núcleo de alginato), que se preparó usando gelificación de gotitas de agarosa que contenían E. coli en emulsión de aceite. Las flechas indican células de E. coli teñidas con SYBR Green I. Barra = 100 µm.

La calidad de los genomas amplificados unicelulares (SAG) usando MDA-in-AGM se evaluó y comparó con la obtenida por FACS-MDA. Los AGM que contenían ADN amplificado que se tiñeron con SYBR Green I se transfirieron individualmente a tubos de PCR de 0,2 ml con 29 µl de agua estéril bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con un micromanipulador TransferMan NK2 (Eppendorf), que requirió aproximadamente 5 min por AGM. El micromanipulador se utilizó en este estudio debido a su bajo costo inicial. Varias decenas de los AGM seleccionados se secuenciaron de la siguiente manera. El ADN amplificado en el AGM se liberó en agua calentando los tubos a 60 °C durante 5 min y se usó directamente para la preparación de bibliotecas de secuenciación utilizando el kit de biblioteca de ADN QIAseq FX (Qiagen). No fue necesaria una segunda ronda de MDA para obtener bibliotecas adecuadas para la secuenciación del genoma. Las lecturas de secuencias de extremos emparejados se generaron en una plataforma Illumina MiSeq con el Reagent Kit V3 (600 ciclos), y se eligió aleatoriamente un número fijo de pares de lecturas y se ensamblaron de novo en contigs utilizando SPAdes 3.13.028 después del filtrado de calidad estándar. Se utilizaron contigs > 1 kb para los análisis posteriores. Se evaluaron varios factores que describen la calidad de la secuencia del genoma, incluida la integridad y la tasa de contaminación, utilizando CheckM29 y QUAST30 y se compararon entre los SAG obtenidos utilizando MDA-in-AGM y FACS-MDA.

La integridad del genoma y la longitud total de la secuencia de los SAG de E. coli obtenidos por MDA-in-AGM aumentaron rápidamente durante el esfuerzo de secuenciación, y la integridad del genoma promedio alcanzó el 93,3 % ± 4,1 % (n = 10) para ensamblajes con una cobertura de 60 veces , mientras que fue del 33,7% ± 17,3% (n = 10) en FACS-MDA (prueba t de Student, P <0,01) (Fig. 3a, Tabla complementaria S2). El genoma cubierto calculado mediante lecturas cartográficas de la secuencia del genoma de E. coli DH5α de referencia (BOCF01000000) fue del 97,4 ± 2,1 % en MDA-in-AGM (n = 10), que fue mucho mayor que el 47,8 % ± 13,5 % en FACS-MDA (n = 10) para lecturas de cobertura de 60 veces (P < 0,01) (Tabla complementaria S2). La fuerte disminución en el número de contigs, es decir, el ensamblaje suave de contigs, en MDA-in-AGM a lo largo de la profundidad del esfuerzo de secuenciación probablemente se debió al menor sesgo de amplificación (Fig. 3a). Además, el sesgo de amplificación entre las regiones del genoma, que es inherente a MDA, mejoró mucho en MDA-in-AGM en comparación con FACS-MDA (Fig. 3b). El sesgo de amplificación de los SAG se evaluó aún más utilizando los coeficientes de Gini y las curvas de Lorenz, que indican la disparidad de la población como índices y gráficos. Los coeficientes de Gini de los SAG obtenidos por MDA-in-AGM fueron mucho más bajos que los de FACS-MDA (prueba t de Welch, P < 0.01), lo que indica una mayor uniformidad de MDA-in-AGM que los FACS-MDA (Fig. .S5a). En la curva de Lorenz, los SAG obtenidos por MDA-in-AGM mostraron una mayor uniformidad de amplificación que los de FACS-MDA (Fig. S5b complementaria). En la Tabla complementaria S3 se muestran otras métricas de calidad de SAG que utilizan todas las lecturas de secuencia.

Comparación de la integridad del genoma y el sesgo de amplificación de genomas unicelulares obtenidos por MDA-in-AGM y FACS-MDA. ( a ) Integridad y número de contigs de SAG durante el proceso de secuenciación. Se muestran diagramas de caja y violín (azul: MDA-in-AGM; rojo: FACS-MDA) para Escherichia coli y dos especies bacterianas como ejemplos de la comunidad simulada de bacterias intestinales humanas (Tablas complementarias S2, S5 y S6). Los puntos de datos (círculos morados) y sus medias aritméticas (rombos) se muestran en los gráficos. En los gráficos de E. coli, también se muestran los resultados del ADN preparado a partir de células de E. coli cultivadas sin MDA (círculos verdes). En los paneles de la izquierda, las diferencias significativas se indican con asteriscos (P < 0,05) o dobles asteriscos (P < 0,01). (b) El número de lecturas de secuencia mapeadas contra regiones del genoma se muestra como un indicador del sesgo de amplificación causado durante la MDA. Se muestran los números de lecturas correspondientes a las diferentes coberturas utilizadas para el ensamblaje de novo (que se muestra como 'Cov.') y la integridad del genoma (%) ('Compl.') estimado mediante CheckM.

Para evaluar la viabilidad de MDA-in-AGM en una muestra más realista, construimos una comunidad simulada que comprende 15 cepas cultivadas de bacterias intestinales humanas. La taxonomía y las composiciones de cada cepa bacteriana estimadas mediante el análisis de amplicón de ARNr 16S o el análisis de metagenoma se muestran en la Tabla complementaria S4. Los SAG de la comunidad simulada se obtuvieron utilizando MDA-in-AGM o FACS-MDA de la misma manera que se indicó anteriormente. Las composiciones taxonómicas de los SAG fueron similares entre MDA-in-AGM y FACS-MDA, los cuales recuperaron con éxito los SAG de la mayoría de las cepas que representan> 5% de la comunidad simulada con la excepción de Faecalibacterium prausnitzii (Tabla complementaria S4). Por ejemplo, los SAG de Bacteroides thetaiotaomicron y Parabacteroides distasonis exhibieron diferencias claras entre MDA-in-AGM y FACS-MDA en la integridad del genoma, el número de contigs y el sesgo de amplificación, como se ve en los SAG de E. coli (Fig. 3, Fig. Suplementaria). . S5). Dado que muchos SAG obtenidos de muestras ambientales eran difíciles de comparar con la misma cobertura debido a la falta de sus genomas de referencia, los SAG simulados se ensamblaron utilizando pares de lectura de 0,3 M en los siguientes experimentos. La integridad del genoma general de los SAG con < 5 % de contaminación fue significativamente mayor en MDA-in-AGM (68,0 % ± 23,3 %, n = 39) que en FACS-MDA (42,4 % ± 20,5 %, n = 36) (P < 0,01) (Tablas complementarias S5, S6). Los SAG de la mayoría de las otras cepas también mostraron resultados similares a los SAG de E. coli (Figura complementaria S6).

La mayoría de las lecturas de secuencias se mapearon en sus respectivos genomas de referencia: las tasas de mapeo medianas fueron del 95,1 % y el 97,6 % para SAG de MDA-in-AGM y FACS-MDA, respectivamente (Tabla complementaria S7). Aunque las tasas de contaminación cruzada fueron ligeramente más altas en MDA-in-AGM que en FACS-MDA, ambas fueron inferiores al 5% (Tabla complementaria S7). En Bá. thetaiotaomicron SAG, lecturas de secuencia de un Ba. también se obtuvieron el plásmido taiotaomicron (Tabla complementaria S7). Nuestros resultados indicaron que MDA-in-AGM es aplicable a varias especies bacterianas y mejora la integridad del genoma tanto en bacterias grampositivas como gramnegativas, independientemente de su contenido de GC (Fig. 4). Para Fa. prausnitzii, es posible que el proceso de lisis celular con KOH no fuera efectivo y, por lo tanto, no se obtuvieron SAG ni en MDA-in-AGM ni en FACS-MDA.

Relaciones entre la integridad del genoma y el contenido de GC de genomas unicelulares en la comunidad simulada de bacterias intestinales humanas. Los genomas amplificados de una sola célula (SAG) de la comunidad simulada que comprende 15 cepas de bacterias intestinales humanas se trazan con sus contenidos de GC frente a la integridad de su genoma. Los SAG se ensamblaron a partir de 0,3 M de pares de lectura elegidos al azar, mientras que MS485-1-51 de MDA-in-AGM (0,26 M de pares de lectura) y CS1–94 de FACS-MDA (0,29 M de pares de lectura) usaron todos los pares de lectura ya que eran menos de 0,3 M. Las especies bacterianas que componen la comunidad simulada y los resultados detallados se muestran en las Tablas complementarias S4–S6. Azul y rojo indican MDA-in-AGM y FACS-MDA, respectivamente. Los cuadrados, círculos y rombos indican bacterias grampositivas, gramnegativas y gramvariables, respectivamente.

Los SAG de MDA-in-AGM con > 5 % de contaminación, que serían causados por la contaminación del ADN extracelular o por el encapsulamiento de múltiples células en una sola AGM, se agruparon en cada especie bacteriana usando metaWRAP31, aunque la discriminación entre el ADN contaminante y el ADN de capturar múltiples células fue difícil. Como resultado, se obtuvieron 30 SAG adicionales con < 5 % de contaminación, y las tasas de integridad y contaminación de su genoma fueron del 73,5 % (mediana) y del 0,9 % (mediana), respectivamente (Tabla complementaria S8).

El reordenamiento del ADN durante la MDA, es decir, la formación de quimeras, puede complicar el ensamblaje de novo de genomas unicelulares32. En E. coli SAG, las tasas de lecturas quiméricas fueron ligeramente más altas en MDA-in-AGM (6,28 % ± 1,09 %) que en FACS-MDA (4,49 % ± 1,32 %) (prueba t de Welch, P < 0,01; Tabla complementaria S3). En los SAG de la comunidad simulada, las tasas de lecturas quiméricas fueron más altas en MDA-in-AGM (8,22 % ± 2,28 %) que en FACS-MDA (3,55 % ± 1,07 %) (prueba t de Welch, P < 0,01; Tablas complementarias S5, S6). Estas tasas de lecturas quiméricas en MDA-in-AGM fueron similares o ligeramente superiores a la tasa del 6,19 % en un estudio anterior que utilizó un método MDA convencional para secuenciar genomas haploides humanos33.

Finalmente, aplicamos MDA-in-AGM a una muestra ambiental natural. Utilizamos la microbiota del intestino de la termita Reticulitermes speratus, que comprende varios cientos de especies bacterianas de diversos filos34. La microbiota intestinal de las termitas ha atraído a los investigadores especialmente por el complejo sistema simbiótico que permite la degradación altamente eficiente de la biomasa vegetal35,36,37. La microbiota intestinal de las termitas también es superior para un estudio comparativo que utiliza una muestra ambiental natural porque la estructura de su comunidad bacteriana es muy consistente dentro de una especie de termitas y ha sido bien caracterizada34,36,38,39 y, además, las secuencias genómicas completas de las especies dominantes. Se han informado especies bacterianas en intestinos de R. Speratus40,41,42.

Se extrajeron las vísceras enteras de cinco termitas obreras y se suspendieron los contenidos de las vísceras. Luego, las células bacterianas se recogieron a 18.000 × g durante 5 min por centrifugación después de digerir el ADN extracelular con DNasa I, y las células se lavaron con agua estéril como se describió anteriormente43. Los procedimientos posteriores fueron los mismos que los descritos anteriormente. Para evaluar MDA-in-AGM utilizando muestras ambientales de las tripas de termitas, analizamos 48 SAG obtenidos por MDA-in-AGM. Los SAG mostraron una integridad del genoma alta (78,6 % ± 18,2 %) y una tasa de contaminación baja (1,0 % ± 1,0 %) (Tabla 1). Los SAG se clasificaron taxonómicamente utilizando el Genome Taxonomy Database Tool Kit (GTDB-Tk)44 y se asociaron con 13 clases de bacterias, incluidos los grupos dominantes conocidos en el intestino de las termitas, Spirochaetia, Bacteroidia, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria y Clostridia34,38 . Por el contrario, la integridad del genoma de los SAG obtenidos por FACS-MDA fue solo del 37,7 % ± 19,0 % (n = 161). Aunque en este último caso se utilizó un método de secuenciación diferente, es decir, una combinación del kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT (Illumina) y la plataforma Illumina HiSeq 2500 (500 ciclos), el número de lecturas (bases) utilizadas para el ensamblaje fue mucho mayor. mayor en promedio (551 Mb ± 64 Mb, n = 161) que en el análisis de SAG obtenidos por MDA-in-AGM (256 Mb ± 49 Mb, n = 48) (Tabla complementaria S9).

Además de los 48 SAG, analizamos 18 SAG de la clase Endomicrobia con tamaños de genoma pequeños (~ 1 Mb) 40 obtenidos por MDA-in-AGM, y se obtuvo una integridad del genoma del 91,2% ± 9,8%. Además, entre ellos, se compararon ocho SAG del filotipo Rs-D17 con las secuencias del genoma completo obtenidas previamente40,41. Las coberturas del genoma calculadas mediante lecturas de mapeo en los dos genomovars de Rs-D17 (Ri200840 y Ti200541) alcanzaron el 95,7 % ± 1,3 % y el 96,7 % ± 0,9 %, respectivamente (Tabla complementaria S10). La composición de la comunidad intestinal de termitas se estimó a partir de los SAG obtenidos por MDA-in-AGM o análisis de amplicón de ARNr 16S (Tabla complementaria S11). La composición taxonómica de los SAG mostró una alta correlación positiva (R = 0,834, P < 0,01; coeficiente de correlación de Pearson) con la mostrada por el análisis de amplicón 16S rRNA, mientras que las frecuencias de bacterias grampositivas fueron menores en los SAG.

MDA-in-AGM, que consistía en MDA masivamente paralelos en los núcleos AGM a escala de picolitros, mejoró drásticamente la integridad del genoma de los SAG de E. coli, una comunidad simulada de bacterias intestinales humanas y bacterias en el intestino de termitas, en comparación con convencional escala de microlitros FACS-MDA. Entre ellos, los SAG de alta cobertura obtenidos de bacterias intestinales de termitas utilizando MDA-in-AGM (Tabla 1, Tabla complementaria S9) impulsarán la comprensión del complejo sistema simbiótico intestinal y los mecanismos del sistema de descomposición de lignocelulosa altamente eficiente34, 36,40,41,43. Por lo tanto, este método puede revelar la capacidad metabólica de procariotas aún no cultivadas en entornos como el tracto intestinal de los animales, el suelo y la hidrosfera.

La mejora de la integridad del genoma en la genómica unicelular mediante la reducción del volumen de reacción de MDA mediante técnicas de microfabricación se informó anteriormente10,15,17,20,45, y las comparaciones de MDA-in-AGM con esos otros métodos de MDA se muestran en Tabla complementaria S12. Aunque también se logra una gran integridad del genoma utilizando otros métodos MDA miniaturizados, MDA-in-AGM no requiere equipos especializados y proporciona una preparación de muestras escalable. Además, el uso de núcleo de sol de alginato mejoró con éxito el rendimiento de MDA, lo que llevó a la eliminación de un paso de MDA de segunda ronda20,45 y, por lo tanto, a un menor sesgo de amplificación y a un flujo de trabajo más simple. Este alto rendimiento probablemente se deba a la mayor difusividad del ADN amplificado en el núcleo del sol46. Nuestro MDA-in-AGM es aplicable a bacterias grampositivas y gramnegativas y también a genomas con alto contenido de GC (Fig. 4). Las ventajas adicionales del AGM son su estabilidad física y su permeabilidad a las moléculas pequeñas, lo que facilita el intercambio de tampones y el manejo físico de la papilla.

La formación de secuencias quiméricas durante la MDA puede afectar la eficiencia y la precisión del ensamblaje de novo de los SAG47. En la comunidad simulada, las tasas de lecturas quiméricas fueron comparables con las de la gota MDA19 y ligeramente más altas que en los métodos MDA convencionales (Tabla complementaria S12)33. Dado que la formación de quimeras probablemente se deba a la migración de ramas del ADN amplificado32, una temperatura de reacción de MDA más alta mediante el uso de ADN polimerasa phi29 termoestable14 puede disminuir la hibridación errónea entre replicones.

La uniformidad de los tamaños de núcleo de alginato, que corresponden a los volúmenes de reacción de MDA (Tabla complementaria S1), puede haber afectado los rendimientos de AGM amplificado con ADN, la uniformidad de las cantidades de productos de MDA y la calidad de las bibliotecas de AGM. Aunque se utilizaron núcleos de alginato con un diámetro de <100 µm para las preparaciones de AGM, una selección de tamaño más estrecho de los núcleos de alginato, por ejemplo, de 20 a 40 µm de diámetro, mejoraría la uniformidad de los núcleos de AGM. La extrusión48 y los microcanales17,18,19 también mejorarían la uniformidad del núcleo AGM sin selección de tamaño. Sin embargo, la introducción de estos procesos complicará el flujo de trabajo y aumentará el costo.

El procedimiento de selección manual con un micromanipulador es el paso limitante de la velocidad en la genómica unicelular que utiliza MDA-in-AGM. Para aumentar el rendimiento, se puede adaptar la clasificación AGM utilizando FACS o códigos de barras moleculares49 de SAG, aunque estos enfoques también reducen la simplicidad y el bajo costo del presente protocolo.

La composición taxonómica de los SAG obtenidos por MDA-in-AGM fue en gran medida consistente con la mostrada por los análisis metagenómicos y de amplicón de 16S rRNA; sin embargo, un SAG del Fa dominante. prausnitzii no se recuperó ni en MDA-in-AGM ni en FACS-MDA (Tabla complementaria S4). Por lo tanto, esta falla no fue específica de MDA-in-AGM sino que fue atribuible al procedimiento de MDA. Se encontraron discrepancias similares en la composición taxonómica en clases de bacterias grampositivas en experimentos que utilizaron microbiota intestinal de termitas (Tabla complementaria S11), por lo que es posible que se requiera una modificación del procedimiento de lisis celular, incluida la adición de lisozima, para ciertas bacterias grampositivas. Aunque todavía no lo hemos intentado, la lisozima con un tamaño de 4 nm50 se difundirá a través de una cubierta de gel de agarosa que consiste en un 2 % de agarosa de bajo punto de fusión (tamaño de poro de 200 nm)51 y lisará la pared celular bacteriana en el núcleo. Para optimizar tales condiciones, AGM también es superior porque el intercambio de la solución es más fácil en comparación con otros métodos.

La integridad promedio más baja del genoma de la comunidad simulada (68 %) y el microbioma intestinal de termitas (79 %) en comparación con el de E. coli (93 %) (Tablas complementarias S2, S5, Tabla 1) puede deberse a las diferencias en la facilidad de lisis celular. En estudios previos se informó una baja integridad del genoma de los SAG en ciertos linajes bacterianos y muestras ambientales, en comparación con los SAG de E. coli cultivada, independientemente de los métodos MDA1,52. Por ejemplo, en MDA unicelular de gotitas, se ha encontrado que la integridad del genoma de E. coli y la microbiota del suelo es del 96,5 % ± 2,2 % (n = 16) y del 52,8 % ± 24,3 % (n = 17), respectivamente19. La optimización de la lisis celular para diferentes cepas procarióticas y muestras ambientales también es importante para aumentar la integridad del genoma.

Recientemente, mientras nuestros experimentos estaban en curso, se publicó un informe que muestra que la MDA usa una microcápsula de hidrogel de núcleo hueco que consta de una cubierta de gel de PEG reticulado y un núcleo de sol de dextrano, una estructura de cápsula similar a AGM46. Aunque no se ha evaluado el sesgo de amplificación, la MDA de una sola célula en el núcleo aumenta la cantidad de producto de MDA en comparación con la MDA en la perla de gel. Además, la cubierta de una microcápsula de hidrogel de núcleo hueco evita que el ADN genómico se escape del núcleo después de la desnaturalización alcalina antes de la MDA. Sin embargo, la luz ultravioleta cercana (365 nm) utilizada para la reticulación fotoquímica de la cubierta de PEG daña las células y el ADN debido a la fotooxidación53. Seleccionamos la agarosa como la cubierta AGM porque permite una gelificación reversible térmicamente suave, está disponible comercialmente y es estable en presencia de reactivos MDA, especialmente solución alcalina, tampón de neutralización y EDTA.

Los AGM u otras cámaras de reacción que contienen células bacterianas individuales inevitablemente producen una proporción de cámaras que contienen múltiples células bacterianas21, y es difícil eliminar por completo el ADN contaminante en nuestros procedimientos experimentales, como en otros métodos desarrollados previamente1. Sin embargo, la aplicación de un programa informático para agrupar fragmentos metagenómicos, como metaWRAP31, nos permitió recuperar una cantidad considerable de SAG de calidad media como mínimo a partir de contenedores de mini metagenoma que resultaron de múltiples células mediante la eliminación de secuencias contaminantes (Tabla complementaria S8) .

En los últimos años, se han publicado numerosos estudios que analizan genomas ensamblados en metagenomas a partir de muestras ambientales54. Aunque la genómica unicelular tiene diferentes ventajas y aumenta potencialmente la calidad de la investigación en combinación con la metagenómica, por ejemplo, al revelar la heterogeneidad a nivel de cepa55 y al proporcionar información sobre los componentes genéticos transferidos horizontalmente45, es difícil de realizar para muchos microbiólogos. MDA-in-AGM es un método mucho más fácil y menos costoso de genómica unicelular y, además, solo se necesita una pequeña cantidad de muestra. Por lo tanto, este método también es adecuado para muestras diminutas, como el tracto intestinal de pequeños insectos y células protistas con comunidades bacterianas endo- y ecto-simbiontes.

Se usó agua destilada libre de DNasa/RNasa ultrapura (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) para todas las soluciones preparadas internamente. Las soluciones se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 min y luego se descontaminaron con radiación UV a 7,2 mW/cm2 durante la noche (12 h) en una cabina de flujo laminar.

Shiraishi Central Laboratories (Hyogo, Japón) proporcionó una suspensión de nanopartículas de CaCO3 uniformes (9,4 % p/v, 100 nm de diámetro, pH 10). La conductividad y el pH de la suspensión de CaCO3 se redujeron lavando las partículas con tres volúmenes de agua. Además del CaCO3 de Shiraishi, también se usó carbonato de calcio fino como el carbonato de calcio precipitado BioUltra (de aproximadamente 3 µm de diámetro; Sigma, St. Louis, MO) para la gelificación del núcleo de alginato. La solución de alginato (5 %, p/v) se preparó disolviendo alginato de sodio (80–120 cP al 1 %, p/v; Wako, Osaka, Japón) en agua y se almacenó a 4 °C. La solución de agarosa se preparó disolviendo SeaPlaque (2 % final, p/v; Lonza, Basilea, Suiza) en agua y se almacenó a 4 °C. Poligliceril-6 octacaprilato (PGO; Nisshin Oillio, Tokio, Japón), tampón Tris-EDTA (TE; BioUltra para biología molecular, pH 7,4; Sigma) y REPLI-g UltraFast Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) se utilizaron como descrito abajo.

Después de mezclar una solución de agarosa (2 ml) con PGO o ISA, cada uno con monooleato de sorbitán al 0,25 % (Span 85; Wako) (v/v) (20 ml, 35 °C), agitando en vórtex y gelificando en hielo, las perlas de agarosa se recuperaron de PGO o ISA como se describe a continuación. Los agregados grandes de agarosa se eliminaron de las perlas de agarosa utilizando filtros celulares de 300 µm (pluriSelect, Leipzig, Alemania). Las perlas de agarosa se observaron bajo un microscopio de fluorescencia invertido (IX71; Olympus, Tokio, Japón) equipado con una cámara CCD (BU-51LN; Bitran, Saitama, Japón). Los diámetros de las perlas de agarosa de más de un píxel en las imágenes (1,28 µm) se midieron con ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Los rendimientos y diámetros de las perlas de agarosa se analizaron estadísticamente con R (https://www.r-project.org/).

Se cultivó Escherichia coli DH5α (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japón) de una sola colonia en una placa LB en dos matraces con medio LB (200 ml). A continuación, las células de E. coli se recogieron y se lavaron dos veces en PBS (20 ml) mediante centrifugación. Las células se resuspendieron en PBS (10 ml) y se determinó su densidad con una cámara de recuento de células. Las células de E. coli (3,05 × 1010 células/mL) se dividieron en alícuotas en microtubos (0,5 mL cada uno) y se almacenaron a -80 °C. Como se menciona a continuación, se analizaron células individuales de E. coli, la muestra simulada y el microbioma intestinal de termitas utilizando células almacenadas a -80 °C, una mezcla de reservas de glicerol almacenadas a -80 °C y muestras vivas de intestinos de termitas. respectivamente.

Las células de Escherichia coli se encapsularon en núcleos de alginato mediante el método de emulsificación/gelificación interna27 (Fig. 1b). Se mezclaron células de E. coli del cultivo madre (10 µL) con 990 µL de solución de alginato de sodio al 2 % que contenía CaCO3 al 1 % y tampón de acetato 50 mM (pH 7,0, Sigma). La mezcla se emulsionó con 9 ml de alcohol isoestearílico (ISA; Kokyu Alcohol Kogyo Co., Ltd., Chiba, Japón) que contenía lecitina al 3 % (Wako) en un tubo de 50 ml mediante agitación vorticial durante 1 min. La emulsión se mezcló con ácido acético al 2 % en ISA (0,1 ml cada uno) mediante agitación vorticial diez veces durante 1 min cada vez. Durante este procedimiento, el pH de la mezcla disminuyó gradualmente a 4,0 y las nanopartículas de CaCO3 se disolvieron. Los iones de calcio liberados del CaCO3 gelificaron las microgotas de alginato en la emulsión. El ISA se eliminó mezclando con 9 ml de éter dietílico y centrifugando a 4 °C durante 3 min usando un rotor oscilante (3000 × g, 5702R, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). El ISA residual se eliminó aún más de los núcleos de alginato mezclándolo con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,2 % (v/v) (Tris-Tween 20) (5 ml), seguido de centrifugación y luego repitiendo el procedimiento dos veces con 1-butanol (5 ml). Los núcleos de alginato resultantes se suspendieron en un volumen de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y se filtraron a través de un filtro celular de 100 µm (pluriSelect) para eliminar los agregados grandes de alginato. Los núcleos de alginato filtrados se lavaron más con Tris-HCl (pH 7,5) y se recogieron en microtubos de 2 ml. El volumen de los núcleos de alginato se calculó a partir de su peso y se almacenaron a 4 °C después de mezclarlos con la mitad del volumen de Tris-HCl (pH 7,5). Para ajustar el número de células de E. coli en un único núcleo de alginato a menos de dos, se mezclaron 10 µL de 3,05 × 106–108 células de E. coli del stock de E. coli con 990 µL de la suspensión de CaCO3 que contenía alginato. Después de preparar núcleos de alginato que contenían E. coli a partir de la mezcla, se observaron E. coli en los núcleos de alginato utilizando SYBR Green I (TaKaRa Bio Inc.) (Fig. S7 complementaria). A 3,05 × 106 células/ml de la mezcla de alginato, el 17,6 % de los núcleos contenían E. coli y el 78,8 % de ellos contenían células individuales. Por lo tanto, se utilizaron 3,05 × 106 células/mL de E. coli para la preparación del núcleo de alginato en experimentos posteriores.

El sobrenadante de la suspensión del núcleo de alginato (600 µL) se eliminó después de la centrifugación en un tubo de 50 mL. Los núcleos de alginato residual (400 µl) se mezclaron con la solución de agarosa preparada anteriormente (2 ml). La mezcla se emulsionó con Span 85 al 0,25 % (v/v) en PGO (20 ml) mediante agitación vorticial durante 1 min (Fig. 1b). Los núcleos de alginato, la solución de agarosa y el PGO se preincubaron a 35 °C durante 10 min para evitar la formación de grandes agregados de agarosa gelificados. Luego, la agarosa se gelificó enfriándola en hielo durante 1 hora. El PGO se eliminó de la emulsión lavando como se describe anteriormente. El núcleo de gel de alginato se aisló quelando iones de calcio con la adición de 1/10 de volumen de EDTA 0,5 M (Thermo Fisher Scientific). A continuación, los AGM se suspendieron en un volumen de tampón TE. Los residuos grandes de la suspensión se eliminaron a través de un filtro de células de 300 µm y los AGM se lavaron más con TE. Los AGM se diluyeron en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía agarosa SeaPlaque al 0,5 %, p-fenilendiamina al 0,1 % (Wako) y SYBR Green I diluido 10 000 veces (TaKaRa Bio Inc.), y la morfología, densidad , el diámetro y el número de células de E. coli encapsuladas se observaron como se mencionó anteriormente. Los AGM se almacenaron a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo (más de una semana), los AGM se almacenaron en etanol al 40 % a -80 °C y se lavaron tres veces en diez volúmenes de agua antes de su uso. La calidad del ADN genómico de los AGM almacenados en EtOH al 40 % se confirmó mediante su amplificación con MDA.

Los núcleos de gel de alginato sin E. coli se marcaron con rodamina 123 (Wako) utilizando clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., TCI, Tokio, Japón) y N-hidroxisuccinimida ( Wako)56. Los AGM que contenían núcleos marcados con rodamina 123 se calentaron a 65 °C durante 5 min en presencia de EDTA 50 mM o CaCl2 50 mM. Se observaron núcleos residuales como se mencionó anteriormente.

Se mezclaron alícuotas (50 µL) de los AGM que contenían células de E. coli antes de la solación de los núcleos de alginato con un volumen de solución de lisis celular que contenía KOH 400 mM con o sin EDTA 10 mM y se neutralizaron con 100 µL de tampón Stop del Mini kit ultrarrápido REPLI-g. Los AGM que contenían E. coli, los AGM sin E. coli (control negativo) y las perlas de agarosa que contenían E. coli (control) se sometieron a MDA como se describe a continuación y se observaron sus ADN amplificados.

Se centrifugó una alícuota de 50 µL de AGM y se lavaron los AGM recolectados con 200 µL de agua. La lisis celular y la desnaturalización del ADN se realizaron con Buffer D2 (50 µL) del Mini Kit REPLI-g UltraFast a temperatura ambiente durante 30 min. Después de detener la desnaturalización con el tampón Stop (50 µL), el sobrenadante se eliminó por centrifugación. Se añadió el tampón de reacción (93,5 µl) que contenía 11 µl de ADN polimerasa phi29 del kit y se incubó a 30 °C durante 3 h (MDA-in-AGM). La reacción se detuvo con 1/10 de volumen de EDTA 0,5 M y los AGM se lavaron tres veces con 200 µl de tampón TE. Los AGM lavados se almacenaron a 4 °C.

Se realizó MDA de una sola célula utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia MoFlo XDP (Beckman Coulter Inc., Brea, CA) como control43. Después de E. coli, la comunidad bacteriana simulada y las bacterias intestinales de termitas se tiñeron con SYBR Green I o CellTracker Green (Thermo Fisher Scientific), y las bacterias teñidas se clasificaron en una sola célula por pocillo de placas PCR de 96 pocillos. La lisis celular se llevó a cabo con Buffer D2 (1,5 µL) del Mini Kit REPLI-g UltraFast a temperatura ambiente durante 30 min. Después de detener la desnaturalización con el tampón de parada (1,5 µL), se añadió el tampón de reacción (7,5 µL) que contenía 0,5 µL de ADN polimerasa phi29 del kit y se incubó a 30 °C durante 3 h y a 65 °C durante 15 min. Para comprobar la amplificación del genoma y el grado de contaminación, los productos MDA se evaluaron mediante secuenciación directa de Sanger del ARNr 16S. La PCR se realizó con cebadores del gen 16S rRNA universal de Bacteria: 27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) y 1390R (5′-ACGGGCGGTGTGTACAA).

Se preparó una comunidad simulada de bacterias intestinales humanas utilizando 15 aislados (Tabla complementaria S4) obtenidos de la Colección japonesa de microorganismos. Se usó una mezcla de todos los stocks de glicerol en cantidades iguales como comunidad bacteriana simulada. Después de que la comunidad bacteriana simulada se diluyera 100 veces con agua, el diluyente (10 µl) se trató con ADNasa I (20 µl) a 30 °C durante 30 min. Las células se lavaron tres veces suspendiéndolas en agua (1 ml), se recogieron mediante centrifugación a 18 000 xg durante 5 min y se suspendieron en agua (10 µl). Después de la MDA en AGM como se describe anteriormente, las AGM se observaron con SYBR Green I usando un microscopio. Entre la gran cantidad de AGM en el campo de visión microscópico, solo unos pocos AGM contenían ADN amplificado, que se aislaron usando un micromanipulador como se describe a continuación.

Para determinar la composición de la comunidad bacteriana simulada, se extrajo el ADN total utilizando el kit microbiano DNeasy Ultra Clean (Qiagen). La secuenciación del metagenoma se realizó mediante la preparación de una biblioteca con el kit de biblioteca de ADN QIAseq FX (Qiagen). La secuenciación de amplicones de los genes 16S rRNA en la comunidad simulada también se realizó mediante la preparación de una biblioteca con los índices Nextera XT Index Kit 96 (Illumina, Inc., San Diego, CA) y la plataforma MiSeq con Reagent Kit V3 (600 ciclos). La composición bacteriana de la comunidad simulada se estimó sobre la base de los resultados analizados en QIIME257.

Se recolectaron especímenes de la termita Reticulitermes speratus que se alimenta de madera en Tsukuba en la prefectura de Ibaraki, Japón. Se extrajeron las vísceras de cinco termitas obreras y el contenido de las vísceras se suspendió en la solución U58, que consistía en NaHCO3 9,2 mM, citrato trisódico dihidrato 5,1 mM, KH2PO4 13 mM, NaCl 37 mM, CaCl2 0,75 mM y MgSO4 0,4 mM. El ADN extracelular y el ADN protista se digirieron usando ADNasa I y las células bacterianas se recogieron a 18 000 xg durante 5 min por centrifugación y se lavaron con agua como se mencionó anteriormente43. Las bacterias intestinales de termitas lavadas se suspendieron en agua (10 µl). Se realizó MDA-in-AGM para las bacterias intestinales de termitas utilizando la suspensión como comunidad simulada.

Los AGM que contenían ADN amplificado, detectados con SYBR Green I, se transfirieron individualmente a tubos de PCR bajo un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un micromanipulador (TransferMan NK2; Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Se añadió agua (29 µL) a cada tubo de PCR con una sola AGM y se incubó a 60 °C durante 5 min para liberar el ADN al aislar la cubierta de agarosa. Para verificar el grado de contaminación, examinamos los productos MDA-in-AGM mediante secuenciación directa de Sanger del gen 16S rRNA como se mencionó anteriormente. Después de retirar las muestras contaminadas, se prepararon bibliotecas de secuenciación con el kit de bibliotecas de ADN QIAseq FX. Dado que los productos de MDA en los núcleos de AGM eran demasiado pequeños para cuantificarlos, los tiempos de fragmentación y ligadura en la construcción de la biblioteca se realizaron utilizando una condición de < 10 ng de ADN de entrada en las instrucciones del fabricante. La secuenciación del genoma se realizó en la plataforma MiSeq con Reagent Kit V3 (600 ciclos). Las bibliotecas de secuencias para células individuales aisladas de la microbiota intestinal de termitas mediante FACS se prepararon con el kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT (Illumina) y se analizaron en la plataforma Illumina HiSeq 2500 (500 ciclos).

Las lecturas cortas generadas se recortaron con Cutadapt (https://github.com/marcelm/cutadapt), PRINSEQ (http://prinseq.sourceforge.net/), FASTX Trimmer, FASTQ Quality Trimmer (http://hannonlab.cshl .edu/fastx_toolkit/download.html) y cmpfastq_pe (http://compbio.brc.iop.kcl.ac.uk/software/download/cmpfastq_pe). Las lecturas recortadas se ensamblaron utilizando SPAdes ver. 3.13.0 (k-mer: 21, 33, 55, 77, 99 y 127, opciones: -sc, -careful)28 en contigs. Solo se seleccionaron contigs de > 1 kb utilizando SeqKit (https://bioinf.shenwei.me/seqkit/) para los análisis posteriores.

La clasificación taxonómica de los genomas unicelulares de muestras intestinales de termitas se llevó a cabo utilizando el kit de herramientas de la base de datos de taxonomía del genoma (GTDB-Tk)44. Los datos de secuencias genómicas que mostraban > 5 % de contaminación, identificados mediante CheckM29, se sometieron secuencialmente a procesos de agrupación, refinamiento y reensamblaje con los módulos BINNING (incluidos metaBAT259, MaxBin260 y CONCOCT61), BIN_REFINEMENT y REASSEMBLE_BINS de metaWRAP31.

Para los análisis del genoma de una sola célula que utilizan E. coli DH5α y bacterias intestinales humanas con una cobertura cada vez mayor (Fig. 3), las lecturas recortadas del adaptador con Trimmomatic62 se eligieron aleatoriamente con Rasusa63 y se ensamblaron de novo con SPAdes28. La integridad del genoma y el número de contigs en los ensamblajes se evaluaron con CheckM29 y se trazaron con R. Las lecturas de secuenciación correspondientes a diferentes coberturas se mapearon en secuencias de genoma conocidas con Bowtie264, y los resultados se visualizaron como mapas de calor con IGV ver. 2.3.26 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/). El genoma cubierto (%), que eran las regiones del genoma cubiertas con al menos una lectura por contenedor de 1 kb, se calculó utilizando BBtools (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/).

Los sesgos de amplificación de los SAG se evaluaron mediante coeficientes de Gini y curvas de Lorenz. Después de mapear las lecturas de secuenciación de SAG en genomas de referencia utilizando Bowtie264, las lecturas se eligieron aleatoriamente para que tuvieran una cobertura de 60 veces (E. coli) y 40 veces (bacterias intestinales humanas) de sus genomas, y se calcularon las profundidades de secuenciación por base a partir de las lecturas usando SAMtools (http://www.htslib.org). Los coeficientes de Gini de los SAG se calcularon a partir de las profundidades de secuenciación media por contenedor de 50 kb utilizando el paquete Rineq. Los SAG, que tenían coeficientes de Gini equivalentes a sus medianas, se representaron en curvas de Lorenz utilizando el paquete R gglorenz.

La tasa de lectura quimérica se calculó asignando lecturas cortas al genoma de referencia con Barrows-Wheeler Aligner (https://sourceforge.net/projects/biobwa/files/) y SAMtools. Los genomas de referencia se enumeran en la Tabla complementaria S4. Las contaminaciones cruzadas de datos de secuenciación genómica con < 5 % de contaminación utilizando CheckM29 (Tabla complementaria S7) se calcularon mediante el mapeo de lecturas de secuenciación a genomas de referencia en la comunidad simulada16.

Los archivos fastq sin procesar (DRR253532–DRR253885) y los ensamblajes para SAG de bacterias intestinales de termitas (BNTM01000000–BOCE01000000) se depositaron en DDBJ con el número de acceso de BioProject PRJDB10679.

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Este trabajo fue apoyado por el Proyecto pionero de RIKEN "Biología de la simbiosis", JSPS KAKENHI Grants 16K07224 a H. A, y 17H01447 y 19H05679 a MO, y el Instituto de Fermentación, Osaka a MY

Estos autores contribuyeron por igual: Hiroyoshi Aoki, Yuki Masahiro, Yuichi Hongoh, Moriya Ohkuma y Yutaka Yamagata.

Equipo de tecnología de óptica de ultra alta precisión, Grupo de tecnología de fotónica avanzada, Centro RIKEN de fotónica avanzada, 3-1, Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japón

Hiroyoshi Aoki y Yutaka Yamagata

Colección japonesa de microorganismos (JCM), RIKEN BioResource Research Center, 3-1-1, Koyadai, Tsukuba, Ibaraki, 305-0074, Japón

Yuki Masahiro, Michiru Shimizu, Yuichi Hongoh y Moriya Ohkuma

Escuela de Ciencias de la Vida y Tecnología, Instituto de Tecnología de Tokio, Tokio, Japón

yuichi hongoh

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YY y MO supervisaron el estudio. HA, MY, YH y MO diseñaron el estudio. HA, MY y YH escribieron el manuscrito. HA desarrolló el protocolo de preparación de AGM. MY y MS realizaron la secuenciación del siguiente genoma y los análisis de datos posteriores. Todos los autores contribuyeron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Hiroyoshi Aoki o Moriya Ohkuma.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Aoki, H., Masahiro, Y., Shimizu, M. et al. Las microcápsulas de gel de agarosa permiten una genómica unicelular fácil de preparar, a escala de picolitros, que produce secuencias genómicas de alta cobertura. Informe científico 12, 17014 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20923-z

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Recibido: 19 enero 2022

Aceptado: 21 de septiembre de 2022

Publicado: 18 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20923-z

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