La empagliflozina suprimió la fibrogénesis cardíaca a través del sodio

Diabetología cardiovascular volumen 22, Número de artículo: 27 (2023) Citar este artículo

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El nuevo inhibidor del cotransportador de sodio-glucosa 2 (SGLT2i) mejora potencialmente la insuficiencia cardíaca y reduce la arritmia cardíaca. La fibrosis cardíaca juega un papel fundamental en la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca y la miopatía auricular, pero el efecto de SGLT2i sobre la fibrogénesis queda por dilucidar. Este estudio investigó si SGLT2i modula directamente las actividades de los fibroblastos y sus mecanismos subyacentes.

Se aplicaron análisis de migración, proliferación, ensayo de pH intracelular, ensayo de trifosfato de inositol intracelular (IP3), imágenes de fluorescencia de Ca2+ y transferencia Western a fibroblastos auriculares humanos. La empagliflozina (un SGLT2i, 1 o 5 μmol/L) redujo la capacidad de migración y la producción de colágeno tipo I y III. En comparación con las células de control, los fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 μmol/L) exhibieron menor fuga de Ca2+ en el retículo endoplásmico (RE), entrada de Ca2+, trifosfato de inositol (IP3), menor expresión de fosfolipasa C fosforilada (PLC) y menor pH intracelular. En presencia de cariporida (un inhibidor del intercambiador de Na+-H+ (NHE), 10 μmol/L), los fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 μmol/L) y los de control revelaron pH intracelular similar, fuga de Ca2+ en el RE, entrada de Ca2+, PLC fosforilada, pro-colágeno tipo I, expresión de proteína tipo III y capacidad de migración. Además, la empagliflozina (10 mg/kg/día por vía oral durante 28 días consecutivos) aumentó significativamente la función sistólica del ventrículo izquierdo, el ß-hidroxibutirato y disminuyó la fibrosis auricular en ratas con IC inducida por isoproterenol (100 mg/kg, inyección subcutánea).

Al inhibir la NHE, la empagliflozina disminuye la expresión de PLC fosforilada y la producción de IP3, lo que reduce la liberación de Ca2+ en el RE, la entrada de Ca2+ extracelular y las actividades profibróticas de los fibroblastos auriculares.

Los inhibidores del cotransportador de sodio-glucosa 2 (SGLT2i) son una nueva clase de agentes antidiabéticos que reducen el riesgo de muerte cardiovascular y hospitalización en pacientes con insuficiencia cardíaca (IC) y diabetes tipo 2 [1, 2]. SGLT2i puede reducir la fibrosis cardíaca y mejorar la función cardíaca [3, 4]. La fibrosis auricular es una característica distinta y crítica de la miopatía auricular y la arritmogénesis auricular [5, 6]. Los pacientes con IC muestran una mayor incidencia de fibrosis auricular y SGLT2i reduce la presión de llenado de la aurícula izquierda y aumenta la tolerancia al ejercicio y la función diastólica, todo lo cual se correlaciona con la fibrosis auricular [7,8,9,10,11,12]. Sin embargo, aún no está claro si SGLT2i puede modular la fibrogénesis auricular y cómo.

La vía de señalización del calcio (Ca2+) desempeña un papel fundamental en la fibrogénesis e induce la proliferación, la producción de colágeno, la migración y las capacidades de diferenciación de miofibroblastos de los fibroblastos [13,14,15,16]. SGLT2i puede interactuar directamente con el sitio de unión de Na+ extracelular del intercambiador Na+/H+ (NHE), disminuyendo así la actividad de NHE y bajando el pH intracelular [17].

Se ha demostrado que el aumento del pH intracelular induce Ca2+ citosólico a través de la fuga de Ca2+ del retículo endoplásmico (ER) o la entrada de Ca2+ [18, 19]. La actividad de NHE aumenta en pacientes con insuficiencia cardíaca [20, 21] y la inhibición de NHE por caripórido reduce la fibrosis cardíaca en pacientes con insuficiencia cardíaca [22,23,24]. El aumento de la actividad de NHE1 aumenta el pH intracelular y activa la capacidad de migración celular [21, 25]. La dapagliflozina atenúa la expresión del gen NHE1 [26]. En consecuencia, SGLT2i puede suprimir directamente la fibrogénesis al inhibir la señalización de NHE, lo que lleva a un potencial antifibrosis. El propósito de este estudio fue examinar si la empagliflozina, un SGLT2i, puede disminuir la fibrogénesis auricular y estudiar sus mecanismos subyacentes.

Se compraron fibroblastos auriculares humanos de Lonza Research Laboratory (Walkersville, MD, EE. UU.). Los fibroblastos se sembraron en placas de cultivo sin recubrimiento como monocapas en FGM™-3 Cardiac Fibroblast Growth Medium-3 BulletKit (Lonza, que incluye HEPES: 14,999 mmol/L y bicarbonato de sodio: 14,010 mmol/L) a 37 °C con 5 % de CO2. Se utilizaron células de los pases 4 a 6 para evitar posibles variaciones en la función celular. Se demostró que el SGLT2 estaba presente en las células mediante transferencia Western (Archivo adicional 1: Fig. S1 para la expresión de la proteína SGLT2).

La migración de los fibroblastos auriculares se estudió mediante un ensayo de cicatrización de heridas. Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con empagliflozina (1 o 5 μmol/L; MedChemExpress, NJ, EE. UU.) o inhibidor de NHE (cariporida; 10 μmol/L, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. ) durante 48 h en medio de cultivo libre de suero durante 72 h. Seis horas antes del final del tratamiento, las células se rasparon utilizando la punta de una pipeta P200. Cada área de la brecha se evaluó utilizando el software Image J 1.45 s (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.). El área de migración neta después de 6 h se sustrajo del momento del rasguño inicial.

La proliferación de fibroblastos auriculares se midió utilizando un kit comercial MTS (Promega, Madison, WI, EE. UU.) como se describió previamente [27]. En resumen, se sembraron fibroblastos auriculares en una placa de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 3000 células/pocillo. Después de crecer hasta una confluencia del 50 %, las células se incubaron con empagliflozina (1 μmol/L, 5 μmol/L) en medio de cultivo durante 24 h. El crecimiento celular se analizó añadiendo el reactivo MTS 4 h antes del análisis espectrofotométrico.

Western Blot se realizó como se describe anteriormente [28]. Los fibroblastos auriculares tratados con o sin empagliflozina (1 o 5 μmol/l) o caripórido (10 μmol/l) durante 48 h se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación que contenía 150 mmol/l de NaCl, Nonidet P P40, 50 mmol/l de Tris pH 7.4, desoxicolato de sodio al 0,5%, dodecilsulfato de sodio al 0,1% (SDS) y cócteles de inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich). Las proteínas se fraccionaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 10 % y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno equilibrada (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). La proteína fraccionada se analizó con anticuerpos primarios contra actina de músculo liso α (SMA) (1:1000, monoclonal, número de clon: 1A4, Abcam), pro-colágeno tipo IA1 (1:500, monoclonal, número de clon: 3G3, Santa- Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.), pro-colágeno tipo III (1:1000, monoclonal, número de clon: FH7A, Abcam), NHE1 (1:1000, policlonal, Alomone Labs, Jerusalén, Israel) y PLCγ1 fosforilado (1:1000, policlonal, señalización celular, Beverly, MA, EE. UU.), seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorado (Millipore, Darmstadt, Alemania) y se analizaron mediante el software AlphaEaseFC (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE. UU.). La proteína gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Sigma-Aldrich) se usó como control de carga para confirmar una carga de proteína igual y luego se normalizó al valor de las células de control.

El pH intracelular se calculó utilizando un kit de ensayo de pH intracelular fluorométrico Cell Meter (AAT Bioquest, Sunnyvale, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se sembraron fibroblastos auriculares en una placa negra de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 3000 células/pocillo. Después de crecer hasta la confluencia, las células se incubaron con empagliflozina (1 μmol/L) o cariporida (10 μmol/L) durante 6 h. Las células se cargaron con colorante fluorescente permeable a las células sensible al pH 20,70-biscarboxietil-5,6-carboxifluoresceína-acetoximetil éster (BCECF-AM) en tampón de Hanks con HEPES 20 mM y bicarbonato de sodio 4,17 mM durante 1 hora a 37ºC. °C y 5% CO2, en oscuridad. Después del lavado posterior con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se midió la fluorescencia a longitudes de onda de excitación/emisión (Ex/Em) de 505/535 nm y 430/535 nm en un fluorímetro SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.) . La proporción de fluorescencia a 505/535 nm y 430/535 nm se convirtió a una unidad de pH con el kit de tampón de calibración de pH intracelular Spexyte (AAT Bioquest). Los fibroblastos auriculares cargados con BCECF-AM se incubaron con un rango de tampón de calibración (pH 4,5 - 8,0) a 37 °C durante 10 min con nigericina (10 mmol/L), un ionóforo de protones que puede modular el pH intracelular con pH externo en la presencia de 100 − 150 mmol/L K+.

El Ca2+ intracelular se midió con un indicador de Ca2+ radiométrico Fura-2 usando un lector de placa de fluorescencia como se describió anteriormente [29]. Los fibroblastos auriculares se sembraron en placas de cultivo negras de 96 pocillos de fondo plano transparente a una densidad de 5 × 103 células/pocillo, después de la incubación durante la noche, las células se trataron con o sin empagliflozina (1 μmol/L) o cariporida (10 μmol/ L) durante 48 horas. Luego, las células se tiñeron con 5 μmol/L de éster acetoximetílico de Fura-2 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) en una solución libre de Ca2+ con (en mmol/L) KH2PO4 1,2, NaCl 120, MgSO4 1,2, KCl 5,4, HEPES 6, glucosa 10 (pH 7,40) durante 30 min a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. Las mediciones de Ca2+ intracelular se realizaron cada 2 s con un cambio rápido de las longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm y una longitud de onda de emisión constante de 510 nm utilizando un lector de microplacas CLARIOstar PLUS (BMG Lab Technologies, EE. UU.) equipado con dos inyectores y analizado con un Software CLARIOstar MARS (BMG Lab Technologies). La concentración de Ca2+ intracelular en cada pocillo se expresó como la relación de fluorescencia de F340/F380 y se calcularon los cambios de la amplitud de calcio inicial a máxima, así como el área bajo la curva (AUC) del trazado de Ca2+. El tiempo de decaimiento de la entrada de Ca2+ (T50) se calculó desde el pico hasta el 50% del decaimiento.

El Ca2+ intracelular inicial se registró durante 2 min en tampón libre de Ca2+, seguido de un tratamiento conjunto con el inhibidor de Ca-ATPasa de ER (tapsigargina, 2,5 μmol/L, Sigma-Aldrich) para el agotamiento de las reservas de Ca2+ de ER. Después de que el aumento de Ca2+ intracelular de la fuga de Ca2+ del RE inducida por tapsigargina volvió a un estado estable, la concentración de Ca2+ extracelular se aumentó a 2 mmol/L para medir la entrada de Ca2+. El cambio en el Ca2+ intracelular (∆ F340/F380) desde el estado estacionario de Ca2+ extracelular libre hasta el estado de meseta del cotratamiento con thapsigargin se definió como la cantidad de depleción de Ca2+ en el RE y el cambio desde el estado estacionario de Ca2+ post-RE inducido Se usó el aumento de Ca2+ intracelular hasta el estado de meseta bajo una solución de Ca2+ de 2 mmol/L para representar la entrada de Ca2+.

Se analizó la producción de IP3 en lisados celulares de fibroblastos auriculares tratados con o sin empagliflozina (1 μmol/l) o caripórido (10 μmol/l) utilizando un kit ELISA de IP3 humano (Amsbio, Abingdon, RU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de proteína del lisado celular de cada tratamiento se usaron para la normalización.

La inducción de HF se realizó como se describió anteriormente [30]. A ratas macho Wistar (con un peso de 300 a 350 g) se les inyectó por vía subcutánea una única dosis alta de isoproterenol (100 mg/kg). 2 semanas después de la inyección, se analizó mediante ecocardiografía el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS) de estas ratas. Las ratas con LVFS < 45% se incluyeron en los grupos HF [31]. Luego, las ratas HF se trataron aleatoriamente con empagliflozina (10 mg/kg/día durante 28 días, Jardiance, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Ridgefield, CT, EE. UU.) o vehículos. Después de completar el tratamiento de 28 días, tanto las ratas tratadas como las ratas de control macho sanas de la misma edad se sacrificaron con una sobredosis de isoflurano al 5% (en oxígeno) para el análisis histológico. Todos los protocolos con animales se ajustaron a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (NIH Publicación No. 85-23, revisada en 2011) y fueron aprobados por la junta de revisión de ética animal local (LAC-2021- 0223). Los estudios en animales se informan de conformidad con las directrices ARRIVE [32] y con las recomendaciones del British Journal of Pharmacology [33].

Se realizó una ecocardiografía antes de la eutanasia. Las ratas se sedaron con isoflurano al 2 % (en oxígeno), se colocaron en decúbito lateral izquierdo y se escanearon con un escáner de eco disponible en el mercado (sistema cardiovascular de ultrasonido Vivid i, GE Healthcare, Haifa, Israel) con un transductor pediátrico de matriz en fase 10S y una aplicación cardíaca con altas resoluciones temporales y espaciales. La frecuencia de transmisión fue de 10 MHz; la profundidad 2,5 cm; y la velocidad de fotogramas 225 fotogramas/s. Se midieron el diámetro telediastólico del VI (LVEDD), el diámetro telesistólico del VI (LVESD), el grosor de la pared posterior del VI (LVPW) y la frecuencia cardíaca (FC). El acortamiento fraccional (%) se midió como (LVEDD-LVESD)/LVEDD × 100.

El suero sanguíneo se recogió antes de la eutanasia y se analizó para ß-OH utilizando un kit de ensayo fluorométrico de ß-OH (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El análisis de fibrosis auricular se realizó según un método descrito anteriormente con modificaciones [30]. En resumen, los tejidos de la aurícula izquierda (LA) se fijaron en formaldehído al 4%, se incluyeron en parafina y se tiñeron con tinción tricrómica de Masson. Se obtuvieron imágenes de campo claro de los tejidos LA. La fibrosis LA se evaluó utilizando la fracción de volumen de colágeno (la relación entre el área de superficie total de colágeno y el área total de superficie LA). Se evaluó la deposición de colágeno de todos los tejidos LA seccionados a ciegas con el software de análisis HistoQuest (versión 4.0, TissueGnostics, Viena, Austria).

Todos los datos cuantitativos se expresan como media ± error estándar de la media. Una prueba t pareada o no pareada para distribución normal, prueba de suma de rangos de Mann-Whitney para distribución no normal y ANOVA unidireccional o ANOVA de medidas repetidas o ANOVA en rangos con una prueba de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher post hoc se utilizaron para comparar los fibroblastos auriculares en diferentes condiciones. AP < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

En comparación con las células de control, los fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 o 5 μmol/L) exhibieron una menor capacidad de migración y una menor expresión de proteína pro-colágeno tipo I y III de manera dependiente de la dosis (Fig. 1). Sin embargo, los fibroblastos auriculares de control y los tratados con empagliflozina tenían una expresión y tasa de proliferación similares de α-SMA (un marcador de diferenciación de miofibroblastos) (Fig. 1).

Migración celular, producción de colágeno, diferenciación de miofibroblastos y capacidades de proliferación de fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina. A Las fotografías y los datos promediados revelaron los resultados del ensayo de migración de fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 o 5 μmol/L). Los paneles superiores izquierdos mostraban el rasguño inicial (línea de base) en diferentes grupos. Los paneles inferiores izquierdos mostraron las imágenes 6 h después de que se creó el rasguño (después de la migración) (n = 6 experimentos independientes, prueba estadística mediante ANOVA de medidas repetidas unidireccionales). B Las fotografías y los datos promediados revelaron la expresión de pro-colágeno tipo I, III y α-actina de músculo liso (SMA) (n = 6 experimentos independientes, prueba estadística mediante ANOVA unidireccional de medidas repetidas) en control y empagliflozina (1 o 5 μmol/L) de fibroblastos auriculares tratados. Se usó GAPDH como control de carga. C El tratamiento con empagliflozina durante 24 h no tuvo un efecto significativo sobre la tasa de proliferación de fibroblastos auriculares (n = 6 experimentos independientes, prueba estadística mediante ANOVA unidireccional de medidas repetidas). * p < 0,05, # p < 0,01, $ p < 0,005

Figura leyenda en la sección de resultados.

Los fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 μmol/L) mostraron una menor fuga de Ca2+ en el RE inducida por tapsigargina, entrada extracelular de Ca2+ y una disminución más corta de Ca2+ durante la fase de entrada de Ca2+ en comparación con las células de control (Fig. 2) Empagliflozina (1 μmol/L) fibroblastos auriculares exhibieron una menor expresión de PLC e IP3 fosforilados (fig. 2).

Señalización intracelular de Ca2+ en fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina. A Trazado de Ca2+ intracelular representativo del control (paneles superiores izquierdos) y fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 μmol/L, paneles superiores derechos). Cuando se indicó, se añadió tapsigargina al tampón sin calcio para inducir el agotamiento de Ca2+ en el RE. Después de que el aumento de Ca2+ intracelular inducido por la tapsigargina (calcio de ER) volviera al estado estable, la concentración de Ca2+ extracelular se aumentó a 2 mmol/L para medir la entrada de Ca2+. F340/F380 se expresó como el Ca2+ intracelular relativo. El panel inferior izquierdo muestra el cambio (∆ F340/F380) de Ca2+ medido por el área bajo la curva de trazado de Ca2+ (AUC, prueba estadística por prueba t no pareada), el cambio desde el valor inicial hasta la amplitud máxima de calcio (prueba estadística por Mann-Whitney Rank Sum Test), y el tiempo de caída de la entrada de Ca2+ (T50, calculado desde el pico hasta el 50 % de la caída o el final del registro de la imagen de calcio, prueba estadística por prueba t no pareada) en el control (n = 5) y fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (n = 5). B Datos promediados de los niveles de IP3 en las células de control y fibroblastos tratados con empagliflozina (1 μmol/L) durante 48 h (n = 6 experimentos, prueba estadística por prueba t de pares). C Fotografías y datos promediados de la expresión de fosfolipasa C fosforilada (pPLC) en las células de control y fibroblastos tratados con empagliflozina (1 μmol/L) durante 48 h (n = 6 experimentos independientes, prueba estadística por prueba t pareada). Se usó GAPDH como control de carga. * p < 0,05, # p < 0,01, $ p < 0,005

En comparación con las células de control, los fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 μmol/L) exhibieron un pH intracelular más bajo pero tenían una expresión similar de la proteína NHE1 (Fig. 3). En presencia de cariporida (un inhibidor de NHE, 10 μmol/L), los fibroblastos auriculares de control y los tratados con empagliflozina exhibieron niveles similares de pH intracelular, expresión de PLC fosforilada, NHE1, producción de colágeno tipo I, tipo III, capacidad de migración ( Figs. 3 y 4), fuga de Ca2+ en el RE, entrada de Ca2+ extracelular y T50 durante la fase de entrada de Ca2+ (Fig. 5), lo que sugiere que la empagliflozina disminuyó las actividades profibróticas de los fibroblastos auriculares al atenuar la señalización de PLC/receptor de IP3/Ca2+ en el RE a través de la inhibición de la vía de señalización NHE.

Efectos de la empagliflozina en el intercambiador Na+/H+ (NHE) y la señalización aguas abajo. A Datos promediados del pH intracelular en las células de control y fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 μmol/L) cotratados con o sin cariporida (10 μmol/L) durante 48 h (n = 6 experimentos, prueba estadística por repetición unidireccional). mide ANOVA). B Fotografías y datos promediados de la expresión de pro-colágeno tipo I, tipo III, fosfolipasa C fosforilada (pPLC) y proteína NHE1 en células de control y fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 μmol/L) cotratados con o sin cariporida (10 μmol/L) durante 48 h (n = 6 experimentos, prueba estadística mediante ANOVA unidireccional de medidas repetidas). Se usó GAPDH como control de carga. * p < 0,05, $ p < 0,005

Los efectos del inhibidor del intercambiador Na+/H+ (cariporida) sobre la empagliflozina redujeron la migración en los fibroblastos auriculares. Las fotografías y los datos promediados presentan los resultados del ensayo de migración para fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (1 μmol/L) tratados con o sin cariporida (10 μmol/L). Los paneles superiores muestran el rasguño inicial (línea de base) en diferentes grupos. Los paneles inferiores muestran las imágenes 6 h después de que se creó el rasguño (después de la migración) (n = 6 experimentos independientes, prueba estadística mediante ANOVA unidireccional de medidas repetidas). * p < 0,05, # p < 0,01, $ p < 0,005

Señalización intracelular de Ca2+ en fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina o cariporida. Trazado de Ca2+ intracelular representativo de cariporida sola (10 μmol/L, paneles superiores izquierdos) y cariporida (10 μmol/L) mezclada con empagliflozina (1 μmol/L, paneles superiores derechos). Cuando se indicó, se añadió tapsigargina al tampón sin calcio para inducir el agotamiento de Ca2+ en el RE. Después de que el aumento de Ca2+ intracelular inducido por la tapsigargina (calcio de ER) volviera al estado estable, la concentración de Ca2+ extracelular se aumentó a 2 mmol/L para medir la entrada de Ca2+. F340/F380 se expresó como el Ca2+ intracelular relativo. El panel inferior izquierdo muestra el cambio (∆ F340/F380) de Ca2+ medido por el área bajo la curva del trazado de Ca2+ (AUC, prueba estadística por prueba t no pareada), el cambio desde el valor inicial hasta la amplitud máxima de calcio (prueba estadística por prueba estadística por prueba t no pareada) y el tiempo de caída de la entrada de Ca2+ (T50, calculado desde el pico hasta el 50 % de la caída o el final del registro de imágenes de calcio, prueba estadística por prueba t no pareada) en cariporida sola (n = 5) y cariporida mezclada con fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina (n = 5)

Como se muestra en la Fig. 6A, estudiamos los efectos de la empagliflozina sobre la estructura del corazón, la función sistólica, la ß-OH sérica y la fibrosis auricular in vivo. Los resultados de la ecocardiografía revelaron que las ratas tratadas con isoproterenol que recibieron vehículos exhibieron una función sistólica del VI (LVFS) y LVESD más bajas con LVPW, LVEDD y HR similares que las ratas de control. Las ratas tratadas con isoproterenol que recibieron empagliflozina tuvieron una función sistólica del VI (LVFS) más alta con LVESD, LVEDD y HR similares en comparación con las ratas tratadas con isoproterenol que recibieron vehículos (Fig. 7).

Efectos de la empagliflozina en ratas con insuficiencia cardíaca (HF) inducida por isoproterenol. Un esquema que resume el protocolo de tratamiento para ratas Wistar con vehículos receptores de HF inducidos por isoproterenol (100 mg/kg, inyección subcutánea), ratas HF que reciben empagliflozina (10 mg/kg/día por vía oral durante 28 días consecutivos) y ratas de control. Los datos promediados B presentan los resultados de los niveles séricos de ß-hidroxibutirato (prueba estadística mediante ANOVA unidireccional) en ratas HF que reciben vehículos (n = 5), ratas HF que reciben empagliflozina (n = 5) y ratas de control (n = 5 ). C Las fotografías revelan fibrosis auricular (teñida de color azul) estudiada mediante la tinción tricrómica de Masson (prueba estadística mediante ANOVA unidireccional) en tejidos de la aurícula izquierda (AI) de diferentes grupos. Las ratas de control (n = 5) y las ratas HF que recibieron empagliflozina (n = 5) exhibieron una fibrosis LA menos grave que las ratas HF tratadas con vehículo (n = 5). Los niveles de fibrosis de los tejidos de LA se expresaron como la fracción de volumen de colágeno, es decir, la proporción del área de superficie de colágeno total de LA teñida de azul al área de superficie total de LA. * p < 0,05, # p < 0,01, $ p < 0,005

Efectos de la empagliflozina sobre la estructura cardíaca, la función sistólica y la frecuencia cardíaca de ratas con insuficiencia cardíaca (IC) inducida por isoproterenol. Las fotografías y los datos promediados presentan los resultados del acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS, prueba estadística por ANOVA unidireccional), pared posterior del VI (LVPW, prueba estadística por ANOVA unidireccional), diámetro telediastólico del VI (LVEDD, prueba estadística por ANOVA en rangos), diámetro sistólico final del VI (LVESD, prueba estadística por ANOVA unidireccional) y frecuencia cardíaca (HR, prueba estadística por ANOVA unidireccional) en ratas HF que recibieron vehículos (n = 5), ratas HF que recibieron empagliflozina (n = 5) y ratas de control (n = 5). * p < 0,05, $ p < 0,005

Los niveles séricos de ß-OH revelaron que las ratas tratadas con isoproterenol que recibieron empagliflozina tienen un β-hidroxibutirato sérico más alto que las ratas tratadas con HF con vehículos y las ratas de control sanas antes de la eutanasia (Fig. 6B). La tinción tricrómica de Masson mostró que las ratas tratadas con isoproterenol exhibieron una mayor fibrosis LA que las ratas de control y la empagliflozina disminuyó significativamente la fibrosis LA en las ratas tratadas con isoproterenol (Fig. 6C).

Se ha demostrado que la empagliflozina mejora la fibrosis cardíaca en varios modelos experimentales de IC [4], pero los mecanismos subyacentes del efecto antifibrogénico no se han dilucidado por completo. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que informa que la empagliflozina (1 μmol/L) interrumpió la homeostasis del Ca2+ al inhibir la actividad NHE en los fibroblastos auriculares humanos, reduciendo así sus actividades celulares profibróticas. Los cardiomiocitos con sobreexpresión de NHE tenían un pH intracelular más alto. Los ratones con sobreexpresión de NHE exhibieron HF y fibrosis cardíaca, que puede mejorarse con el inhibidor de NHE1 caripórido [34]. En este estudio, observamos que la empagliflozina redujo el pH intracelular de los fibroblastos auriculares sin cambiar la expresión de la proteína NHE1, una isoforma predominante en el corazón [35]. Además, la cariporida con y sin empagliflozina redujo las actividades celulares profibróticas de los fibroblastos auriculares en un grado similar, lo que sugiere que la empagliflozina puede disminuir las actividades de los fibroblastos auriculares al atenuar la activación de la señalización NHE.

El pH intracelular elevado activa la vía de señalización del receptor PLC/IP3, lo que induce la liberación de Ca2+ en el RE o la entrada de Ca2+ [36]. Las citocinas profibróticas inducen la secreción de colágeno a través de la vía de señalización del receptor PLC/IP3, mientras que la inhibición de la vía de señalización PLC disminuye la capacidad de producción de colágeno [37]. En el presente estudio, encontramos que la empagliflozina disminuyó significativamente el pH intracelular, el PLC fosforilado y el IP3 intracelular. Además, la cariporida con y sin empagliflozina redujo el pH intracelular y fosforiló el PLC de los fibroblastos auriculares en un grado similar. Estos hallazgos sugieren que la empagliflozina puede atenuar la fibrogénesis auricular al inhibir la vía de señalización del receptor PLC/IP3 a través de la inhibición de la señalización del NHE. De manera similar, en los miocitos auriculares, la exposición aguda a la empagliflozina redujo el pH intracelular y atenuó la actividad del NHE. Esta atenuación también se logró mediante la incubación con caripórido [38]. La empagliflozina atenuó significativamente el flujo de NHE, reduciendo así el Na+ y el Ca2+ citosólicos en los miocitos ventriculares [39]. En presencia de cariporida, el efecto de atenuación de la empagliflozina se suprimió fuertemente en los fibroblastos auriculares, lo que sugiere que el efecto de la inhibición de NHE fue equivalente al de la cariporida.

Nuestro estudio anterior encontró que la empagliflozina atenuó la reducción del contenido de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico (RS) en los miocitos diabéticos [3]. Además, la empagliflozina también puede disminuir la fuga de Ca2+ en el RE [40], lo que sugiere que la empagliflozina puede disminuir la fuga de Ca2+ en el RE. La inhibición de la fuga de Ca2+ en el RE interrumpe la señalización aguas abajo de la citoquina profibrótica [37] El presente estudio encontró que la empagliflozina redujo la liberación de Ca2+ en el RE inducida por la tapsigargina, lo que sugiere que reguló a la baja la vía de señalización de liberación de Ca2+ en el RE/PLC/IP3/RE al disminuir el pH intracelular a través de la inhibición del NHE, lo que conduce a una disminución de la producción de colágeno. La activación de PLC dependiente de Ca2+ ha sido probada en varias células [41, 42]. El miocardio isquémico perfundido con una solución alta en Ca2+ aumenta la actividad de la PLC, mientras que la perfusión con un bloqueador de los canales de Ca2+ disminuye la actividad de la PLC [43]. SGLT2i redujo el Na+ intracelular al acoplarse directamente en el canal de sodio tardío (Nav1.5), inhibiendo el flujo de entrada de NHE y el modo inverso de NCX, disminuyendo así el contenido de Ca2+ intracelular en los cardiomiocitos [39, 44, 45]. En el presente estudio, encontramos que la empagliflozina reduce significativamente el Ca2+ citosólico. Por lo tanto, el efecto de la empagliflozina sobre la reducción de la actividad de PLC también puede deberse a la disminución del Ca2+ citosólico en los fibroblastos auriculares tratados con empagliflozina. Las puertas de entrada de Ca2+ incluyen los canales de Orai, los canales de potencial receptor transitorio (TRP), los canales de Ca2+ operados por voltaje o NCX. La señalización atenuada del canal de Orai reduce la capacidad de producción de colágeno de los fibroblastos auriculares [46]. El factor de crecimiento transformante activa las actividades profibróticas de los fibroblastos auriculares a través de los canales TRP [47]. El vaciamiento de ER Ca2+ puede activar los canales de Orai [48, 49]. Los canales TRP pueden activarse mediante señalización de PLC [50, 51]. Un estudio anterior reveló que SGLT2i disminuye la vasoconstricción inducida por un alto contenido de sal a través de la inhibición de los canales TRP [45]. SGLT2i también puede disminuir la sobrecarga de Ca2+ a través del canal de Ca2+ de tipo L (un tipo de canal de Ca2+ operado por voltaje) en los cardiomiocitos [52]. En el presente estudio, encontramos que la empagliflozina disminuyó el vaciado de Ca2+ en el RE, la actividad de PLC y la entrada de Ca2+ extracelular. Además, la cariporida con y sin empagliflozina redujo la fuga de Ca2+ en el RE y la entrada de Ca2+ extracelular de los fibroblastos auriculares en un grado similar, lo que sugiere que la empagliflozina puede disminuir, lo que sugiere que la empagliflozina disminuyó el Ca2+ citosólico a través de la inhibición de la vía de señalización NHE.

La extrusión citoplasmática de Ca2+ se puede realizar mediante la salida de Ca2+ a través de las ATPasas de la membrana plasmática (PMCA) y los intercambiadores de Na+/Ca2+ de modo directo en la membrana celular, o mediante el bombeo de Ca2+ de vuelta al RE a través de la SR Ca2+-ATPasa (SERCA) en la membrana del RE. Se ha demostrado que el aumento del pH intracelular inhibe la capacidad de recaptación de Ca2+ del RE de SERCA [53]. En el presente estudio, encontramos que la empagliflozina acortó el tiempo de descomposición de la fase de entrada de Ca2+. Además, la cariporida con y sin empagliflozina acortó el tiempo de descomposición de la fase de entrada de Ca2+ de los fibroblastos auriculares en un grado similar. Por lo tanto, la empagliflozina podría mejorar la función SERCA y aumentar la recaptación de Ca2+ en el RE, acortando así el tiempo de descomposición de la fase de entrada de Ca2+ de los fibroblastos auriculares a través de su efecto sobre la disminución del pH intracelular.

La inhibición de NHE por empagliflozina puede reducir el Ca2+ intracelular y disminuir la contracción cardíaca. Sin embargo, estudios previos han demostrado que la empagliflozina atenúa la IC y aumenta el contenido de Ca2+ en los cardiomiocitos diabéticos, lo que se suponía que surgía de sus efectos potenciadores sobre la expresión de SERCA y las corrientes de calcio tipo L [3]. La reducción de la actividad NHE por empagliflozina puede reducir el estrés oxidativo, lo que lleva a un efecto cardioprotector [3]. Además, la reducción de la fibrogénesis mejora la IC [54, 55]. Por lo tanto, la empagliflozina puede mejorar la IC a través de su potencial antifibrosis y sus efectos inotrópicos (función SERCA mejorada y contenido de Ca2+ en los cardiomiocitos). El isoproterenol activa la señalización de la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKII) e induce una frecuencia de chispa aberrante de Ca2+, lo que induce la arritmogénesis en insuficiencia cardíaca [56, 57]. La empagliflozina modula varios canales iónicos, incluidos los canales de Ca2+ [52], los canales de Na+ [44] y los canales de K+ [58], lo que sugiere que la empagliflozina puede modular la actividad eléctrica cardíaca. Se ha demostrado que la empagliflozina reduce la arritmia ventricular inducida por isoproterenol en el corazón diabético [59]. Se ha demostrado que la empagliflozina disminuye la frecuencia de la chispa de Ca2+ y atenúa las actividades de CaMKII en los cardiomiocitos defectuosos [40]. Por lo tanto, en nuestros modelos de insuficiencia cardíaca, la empagliflozina podría aliviar la disfunción cardíaca inducida por isoproterenol al atenuar la disfunción de SERCA o la fuga de calcio debido al receptor de rianodina fosforilado en la insuficiencia cardíaca mediante la reducción del estrés oxidativo o la actividad de CaMKII [3, 40, 60]. El isoproterenol aumenta la FC a través de la estimulación beta-adrenérgica en la práctica clínica. Además, el tratamiento a largo plazo con isoproterenol puede regular a la baja los receptores adrenérgicos beta-1, lo que lleva a una disminución o pérdida de la eficacia de los agonistas de los receptores adrenérgicos beta [61]. El isoproterenol se ha utilizado ampliamente para la inducción de modelos animales de IC. Sin embargo, el aumento significativo de la FC posterior a la inducción de IC con isoproterenol no es consistente entre los diferentes estudios [62, 63]. En el presente estudio, encontramos que no hay una diferencia significativa entre las ratas control sanas y las ratas HF, lo que posiblemente se atribuya a la frecuencia de la inyección de isoproterenol (una sola vez) y al momento de la medición de la frecuencia cardíaca (6 semanas después de la inyección de isoproterenol).

Los pacientes con DM tratados con SGLT2i exhibieron niveles más altos de cetonas (β-OHB) [64, 65]. SGLT2i activa la lipólisis y disminuye los niveles de insulina, lo que impulsa la producción de cetonas en el hígado [66]. La β-OHB también puede mejorar el gasto cardíaco y la función sistólica de los pacientes con IC [67]. En el presente estudio, encontramos que la función sistólica del VI y el nivel sérico de β-OHB son más altos en ratas HF tratadas con empagliflozina que en ratas HF tratadas con vehículos, lo que sugiere que β-OHB podría contribuir a los efectos cardioprotectores de la empagliflozina.

Una fibrosis auricular más grave se asocia con una mayor incidencia de fibrilación auricular [68]. La empagliflozina disminuyó la fibrosis ventricular en ratas diabéticas [69]. En el presente estudio, la empagliflozina redujo la fibrosis auricular en ratas tratadas con isoproterenol; encontramos que la empagliflozina redujo la fibrosis auricular. Para correlacionar con los entornos clínicos, tratamos los fibroblastos auriculares con 1 μmol/L de empagliflozina (una concentración similar a la concentración plasmática máxima de empagliflozina en pacientes con diabetes tipo 2 después de la ingesta de múltiples dosis orales [70, 71]). Este hallazgo indicó la relevancia clínica del efecto antifibrogénico de la empagliflozina en los fibroblastos auriculares humanos. En consecuencia, SGLT-2i puede ser una posible estrategia terapéutica.

Hubo algunas limitaciones en este estudio. En primer lugar, SGLT2i mejoró las relaciones presión-volumen al final de la sístole y al final de la diastólica en modelos animales diabéticos de acuerdo con experimentos de bucle de presión-volumen [72]. Sin embargo, este estudio no realizó este experimento. Por lo tanto, no está claro acerca de los efectos de SGLT2i en el comportamiento de activación o relajación del miocardio HF. Además, en comparación con las células de control, los fibroblastos auriculares exhibieron un pH intracelular más bajo durante 6 h de tratamiento con empagliflozina a través de la señalización NHE. Sin embargo, no está claro cuánto tarda la empagliflozina en actuar para modificar el pH intracelular en los fibroblastos auriculares. Además, este estudio midió el tamaño de la cámara y la función cardíaca 6 semanas después del tratamiento con isoproterenol. El grosor similar entre las ratas control y HF podría atribuirse a los resultados netos de pérdida de miocardio e hipertrofia compensatoria de miocitos ventriculares. Un estudio anterior reveló que ratas wistar HF adultas jóvenes inducidas con dosis altas (170 mg/kg/d) de isoproterenol tenían un grosor similar de la pared posterior del VI 4 semanas y 8 semanas después de la inducción de HF [73]. De manera similar, la IC inducida por 85 o 170 mg/kg/d de isoproterenol en ratas wistar mostró un aumento de la masa del VI solo a las 16 semanas, pero no a las 2 o 6 semanas después de la inducción de la IC [74]. Estos hallazgos sugieren que la hipertrofia ventricular en la IC inducida por isoproterenol puede depender de la dosis y la duración. Por lo tanto, una mayor duración después del tratamiento con isoproterenol puede tener un impacto diferente en el grosor de la pared posterior del VI. Finalmente, para imitar el escenario clínico, no medimos el efecto de la empagliflozina en corazones de ratas de control, y los efectos de la empagliflozina en animales sanos no se dilucidan en este estudio. Sin embargo, los estudios revelaron que la empagliflozina puede no afectar la fibrosis cardíaca, el grosor de la pared ventricular y la fracción de eyección de ratas sanas [75, 76].

En conclusión, como se resume en la figura 8, al inhibir la NHE, la empagliflozina disminuye la expresión de PLC fosforilada y la producción de IP3, lo que reduce la liberación de Ca2+ en el RE, la entrada de Ca2+ extracelular y las actividades profibróticas de los fibroblastos auriculares.

El mecanismo molecular propuesto que subyace a los efectos antifibróticos de la empagliflozina en los fibroblastos auriculares. Al inhibir el intercambiador de Na+-H+ (NHE), la empagliflozina disminuye la expresión de la fosfolipasa C fosforilada (PLC) y la producción de trifosfato de inositol (IP3), lo que reduce la liberación de Ca2+ en el RE, la entrada de Ca2+ extracelular y la disminución de las actividades celulares profibróticas de los fibroblastos auriculares.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores agradecen los servicios técnicos proporcionados por la Instalación central de la Universidad Médica de Taipei (TMU) para experimentos de imágenes de Ca2+. Los autores agradecen al Centro de Animales de Laboratorio de TMU por el apoyo técnico con este estudio en animales.

Este trabajo fue apoyado por la Universidad Médica de Taipei—Hospital Wan Fang [108-wf-swf-06] y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 108-2314-B-038-117-MY3, MOST 111-2314-B -038-027-MY3).

División de Cardiología, Departamento de Medicina Interna, Escuela de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad Médica de Taipei, Taipei, Taiwán

Cheng-Chih Chung, Yung-Kuo Lin y Yi-Jen Chen

División de Medicina Cardiovascular, Departamento de Medicina Interna, Hospital Wan Fang, Universidad Médica de Taipei, Taipei, Taiwán

Cheng-Chih Chung, Yung-Kuo Lin y Yi-Jen Chen

Instituto del Corazón de Taipei, Universidad Médica de Taipei, Taipei, Taiwán

Cheng-Chih Chung, Yung-Kuo Lin y Yi-Jen Chen

Departamento de Ingeniería Biomédica, Centro Médico de Defensa Nacional, Taipei, Taiwán

Yao Chang Chen

Instituto de Posgrado de Medicina Clínica, Facultad de Medicina, Universidad Médica de Taipei, No. 250, Wu-Hsing Street, 11031, Taipei, Taiwán

Yu-Hsun Kao y Yi-Jen Chen

Departamento de Educación e Investigación Médica, Hospital Wan Fang, Universidad Médica de Taipei, Taipei, Taiwán

Yu-Hsun Kao

División de Cardiología, Hospital Conmemorativo Chang Gung, Taoyuan, Taiwán

Yung-Hsin Yeh

Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Taoyuan, Taiwán

Yung-Hsin Yeh

Centro de Radiología, Hospital Bach Mai, Hanoi, Vietnam

Nguyen Ngoc Trang

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El estudio fue conceptualizado por C-CC, Y-HK e Y-JC. Y-KL, Y-CC y N-NT llevaron a cabo experimentos celulares y con animales. C-CC recopiló los datos con Y-HK e Y-HY y redactó el manuscrito. Y-JC supervisó todo el estudio y revisó y editó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Yu-Hsun Kao o Yi-Jen Chen.

Todos los materiales de células humanas fueron aprobados por la junta de revisión conjunta de la universidad médica de Taipei (TMU-JIRB. No.:N202202048). Todos los protocolos con animales fueron aprobados por la junta de revisión de ética animal local (LAC-2021-0223).

En nombre de todos los autores, el autor correspondiente declara que no hay competencia de intereses.

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Archivo adicional 1: Fig. S1. La proteína SGLT2 se expresa en fibroblastos auriculares humanos.

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Reimpresiones y permisos

Chung, CC., Lin, YK., Chen, YC. et al. La empagliflozina suprimió la fibrogénesis cardíaca mediante la inhibición del intercambiador de sodio-hidrógeno y la modulación de la homeostasis del calcio. Cardiovasc Diabetol 22, 27 (2023). https://doi.org/10.1186/s12933-023-01756-0

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Recibido: 12 agosto 2022

Aceptado: 26 de enero de 2023

Publicado: 06 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12933-023-01756-0

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La empagliflozina suprimió la fibrogénesis cardíaca a través del sodio