Análisis transcriptómico de AAV

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 19395 (2022) Citar este artículo

1700 Accesos

5 Altmetric

Detalles de métricas

Las retinopatías son enfermedades multifactoriales con patologías complejas que finalmente conducen a la pérdida de la visión. Los modelos animales facilitan la comprensión de la fisiopatología y la identificación de nuevas opciones de tratamiento. Sin embargo, cada modelo animal refleja solo aspectos específicos de la enfermedad y la comprensión de los cambios moleculares específicos en la mayoría de los modelos de enfermedades es limitada. Aquí, llevamos a cabo un análisis del transcriptoma de tejido ocular murino transducido con virus recombinantes asociados a adeno (AAV) que expresan VEGF-A, TNF-α o IL-6 humanos. La expresión de VEGF condujo a una regulación distinta de los genes asociados a la matriz extracelular (ECM). Por el contrario, tanto el TNF-α como la IL-6 condujeron a cambios de expresión génica más comparables en la señalización de interleucina y la cascada del complemento, siendo más pronunciados los cambios inducidos por el TNF-α. Además, la integración de datos de secuenciación de ARN de células individuales sugirió un aumento de genes marcadores específicos de células endoteliales por VEGF, mientras que la expresión de TNF-α aumentó la expresión de marcadores de células T. Tanto la expresión de TNF-α como de IL-6 condujo a un aumento en los marcadores de macrófagos. Finalmente, los cambios transcriptómicos en los ratones tratados con AAV-VEGF se superpusieron en gran medida con los cambios en la expresión génica observados en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno, especialmente con respecto a los componentes de la MEC y la expresión génica específica de células endoteliales. En conjunto, nuestro estudio representa una valiosa investigación de los cambios en la expresión génica inducidos por VEGF, TNF-α e IL-6 y ayudará a los investigadores a seleccionar modelos animales adecuados para las retinopatías en función de su concordancia con la fisiopatología humana.

Las retinopatías como la retinopatía diabética (RD), la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), la uveítis o la retinopatía del prematuro (ROP) muestran patologías complejas en los pacientes, que incluyen vasculopatías, inflamación, neurodegeneración y fibrosis, lo que finalmente conduce a la ceguera. Se han asociado una serie de cambios moleculares con estas patologías retinianas, por ejemplo, cambios en la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o la interleucina-6 (IL-6). VEGF provoca fugas vasculares y neovascularización patológica, y se ha demostrado que la proteína VEGF aumenta en AMD1 húmedo, DR2, edema macular diabético (DME)3 y ROP4. En consecuencia, el tratamiento anti-VEGF se ha convertido en el estándar de atención para AMD5 húmedo y DME6. Otra característica común de muchas retinopatías es la inflamación: las citocinas proinflamatorias como el TNF-α y las proteínas IL-6 aumentan en el vítreo de los pacientes con RD7,8 y uveítis9,10.

Varios modelos preclínicos de roedores han arrojado luz directa o indirectamente sobre la función de VEGF, TNF-α o IL-6 en las retinopatías. Un modelo animal de uso frecuente que muestra patologías vasculares, similares a las observadas en las retinopatías proliferativas como la DMRE húmeda o la ROP, es el modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR)11,12. Los ratones transgénicos que expresan VEGF13,14,15, la inyección intraocular de proteína VEGF recombinante16,17,18 o los virus adenoasociados (AAV) recombinantes que expresan VEGF19,20,21,22,23 demostraron además que VEGF no solo es necesario sino también suficiente para causar vasculopatías. En consecuencia, el tratamiento anti-VEGF previene la neovascularización en el modelo OIR17,24 y estos estudios preclínicos allanaron el camino para las modernas terapias anti-VEGF. Además, los procesos inflamatorios observados en pacientes con retinopatías también se pueden modelar en roedores, por ejemplo, mediante modelos de uveítis en ratones como la uveítis inducida por endotoxinas o antígenos25,26,27 o ratones transgénicos que carecen del gen Aire28,29. De manera similar, las proteínas recombinantes o la expresión de TNF-α e IL-6 mediada por AAV inducen inflamación en el ojo de roedores, aunque la función directa de IL-6 es más controvertida19,30,31,32. De nuevo, el tratamiento con anti-TNF-α o anti-IL-6 mejora las patologías inducidas en diversos modelos de uveítis33,34,35.

En el contexto de la investigación preclínica, la transferencia de genes mediada por AAV ha surgido recientemente como un método poderoso para crear nuevos modelos animales. Como beneficio principal, los AAV permiten la expresión a largo plazo de un transgén en una forma específica de tejido y tipo de célula. Previamente, hemos demostrado que la expresión mediada por AAV conduce a una expresión constante y a largo plazo de transgenes humanos a las 1, 3 y 6 semanas después de la inyección IVT19. Además, demostramos que la expresión mediada por AAV de VEGF, TNF-α e IL-6 humanos en el ojo murino conduce a patologías retinianas específicas de la vía y relevantes para los humanos. En resumen, la expresión de VEGF impulsada por AAV indujo fuga vascular y neovascularización. Por otro lado, las citocinas proinflamatorias TNF-α e IL-6 activaron las células inmunitarias. El TNF-α también condujo a vasculitis, fibrosis y desarrollo de membranas epirretinianas fibróticas.

En los últimos años, las técnicas de secuenciación de próxima generación permitieron una investigación detallada de los cambios moleculares en las retinopatías y permitieron una mejor comprensión de la progresión de la enfermedad en pacientes con DMAE y RD36,37,38. De manera similar, se ha secuenciado y analizado el transcriptoma de múltiples modelos de retinopatías en roedores39,40,41,42. Para el modelo OIR, varios estudios identificaron cambios en la expresión génica dependientes del punto temporal relacionados con la hipoxia, la angiogénesis y la inflamación43,44,45,46,47. Sin embargo, todavía faltan comparaciones con otros modelos de retinopatías en ratones. Además, los enfoques modernos de secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-Seq) brindaron conocimientos sin precedentes sobre la organización celular de los tejidos oculares de mamíferos sanos y enfermos48,49,50,51,52,53,54. Con más detalle, Heng et al. demostrado por secuenciación de células individuales de ratones Aire-/-, un modelo de uveoretinitis espontánea, que una población muy diversa de células inmunitarias invade la retina de ratones Aire-/- y que las células Th1 representan las principales células T efectoras en este modelo, destacando la gran potencial de tales enfoques de secuenciación de células individuales. A medida que aumenta la cantidad de conjuntos de datos masivos y unicelulares disponibles en el contexto de las retinopatías, también aumenta el potencial para integrar datos de varios modelos de retinopatía y compararlos a nivel molecular.

En este estudio, proporcionamos análisis transcriptómicos de AAV recombinantes inyectados intravítreamente que expresan VEGF, TNF-α o IL-6 humanos en ratones. Observamos que la expresión de transgenes humanos mediada por AAV introdujo respuestas transcriptómicas distintas: mientras que TNF-α e IL6 mostraron cambios en la expresión génica superpuestos, la sobreexpresión de VEGF condujo a una respuesta más distinta en comparación con TNF-α e IL-6. Más detalladamente, al investigar las vías afectadas por cada condición experimental, VEGF condujo a una regulación específica de los genes relacionados con la matriz extracelular (ECM), mientras que TNF-α e IL-6 indujeron cambios en la señalización de interleucina. Además, identificamos cambios de expresión génica específicos asociados con TNF-α que incluían moléculas de adhesión celular, como Madcam1, y además demostramos una regulación conservada de MAdCAM-1 por TNF-α en células endoteliales de la retina humana. Mediante la integración de datos de secuenciación de ARN de células individuales, pudimos mostrar un aumento de genes específicos de células T después de la expresión de TNF-α y, de hecho, la invasión de células T mediada por TNF-α fue validada por inmunofluorescencia. Además de evaluar los cambios en el transcriptoma en los diversos modelos de ratones transgénicos, generamos un curso temporal detallado de los cambios en el transcriptoma en el modelo OIR establecido. Al comparar los cambios en el transcriptoma en los modelos de sobreexpresión de AAV y los ratones OIR, observamos la mayor superposición entre los ojos tratados con AAV-VEGF y la respuesta tardía (P16) en el modelo OIR, que incluye de manera más prominente cambios en la vía ECM y genes marcadores específicos de células endoteliales. De manera prominente, los cambios específicos de OIR en la regulación génica incluyeron vías de señalización neuronal que no se observaron después de la expresión del transgén AAV-VEGF. En conclusión, nuestro estudio sugiere que cada modelo animal produce distintos perfiles de expresión génica y es necesaria una cuidadosa selección de modelos de acuerdo con los requisitos de las diferentes preguntas de investigación.

Para investigar y comparar los perfiles transcriptómicos de los tejidos oculares que expresan VEGF, TNF-α e IL-6 humanos, inyectamos intravítreamente ojos de ratón con AAV que expresan uno de los tres transgenes humanos (Fig. 1a). Como controles, usamos ojos inyectados con relleno de AAV en concentraciones equivalentes y ojos no inyectados. Tenga en cuenta que AAV-VEGF se inyectó a una dosis viral más baja (1 × 108 VG/ojo), mientras que AAV-TNF-α y AAV-IL-6 se inyectaron a 1 × 109 VG/ojo. Se tomaron imágenes de los ojos de todos los animales in vivo directamente antes de la disección del tejido y la secuenciación del ARN para validar las patologías esperadas y clasificar la gravedad del fenotipo. De acuerdo con nuestro estudio previamente publicado19, las inyecciones de relleno de AAV no indujeron patologías retinianas obvias en ambas concentraciones según la imagen de Autofluorescencia Azul (BAF) (Figura 1 complementaria), angiografía con fluoresceína de fondo (FFA, Figura complementaria 2) y tomografía de coherencia (OCT, Fig. 3 complementaria), aparte de algunas áreas irregulares más brillantes u oscuras de origen desconocido en las imágenes BAF. La inyección de AAV-VEGF en 3 de 6 muestras condujo a una vasculatura agrandada y de crecimiento anormal y fuga vascular como se ve en las imágenes FFA (Fig. 2 complementaria). Los ojos inyectados con AAV-TNF-α exhibieron infiltrados celulares en el vítreo como se muestra en las exploraciones OCT (Fig. 3 complementaria). Finalmente, los ojos inyectados con AAV-IL-6 demostraron focos hiperfluorescentes subretinianos en imágenes BAF (Fig. 1 complementaria).

La expresión mediada por AAV de VEGF, TNF-α o IL-6 humanos conduce a distintos cambios en el transcriptoma. (a) Diseño experimental: Retina y tejido ocular para secuenciación de ARN de 6 grupos de tratamiento (no inyectado, AAV-relleno bajo, AAV-relleno alto, AAV-VEGF, AAV-TNF-α y AAV-IL-6) se recogieron 3 semanas después de IVT y de imágenes in vivo. La imagen fue generada usando BioRender. (b) Expresión específica de los transgenes humanos VEGF, TNF-α e IL-6 en los respectivos grupos de tratamiento tanto en la retina como en el tejido de la copa del ojo (CPM: recuentos por millón). (c) La hibridación in situ con tecnología RNAscope demostró la expresión de los tres transgenes humanos (flechas rosas) en el cuerpo ciliar (panel superior) y la capa interna de la retina central (panel inferior). Tenga en cuenta las células endoteliales anormales alrededor del cuerpo ciliar en los ojos tratados con AAV-VEGF (punta de flecha negra) y las células inmunitarias infiltrantes en los ojos tratados con AAV-TNF-α (flecha negra). (d) PCA demostró grandes diferencias entre tejidos (panel superior) y cambios específicos inducidos por VEGF, TNF-α e IL-6, respectivamente, dentro de cada tejido (paneles inferiores). Dosis baja = 1 × 108 VG/ojo; Dosis alta = 1 × 109 VG/ojo. El porcentaje de varianza explicado por los dos primeros componentes principales se muestra junto con las respectivas etiquetas x e y.

De los seis grupos de tratamiento, se extrajo el ARN total de la retina y la copa ocular posterior, incluido el epitelio pigmentario de la retina (RPE), la coroides, la esclerótica y el cuerpo ciliar. Aparte de dos muestras que se excluyeron debido a un bajo número de integridad de ARN (RIN), se secuenciaron seis réplicas biológicas por grupo. Las bibliotecas de secuenciación se secuenciaron a una profundidad promedio de 31,3 millones de lecturas, con un mapeo del 80,1 % en transcritos de ARNm y un contenido bajo de ribosomas (2,1 %), lo que sugiere una buena calidad general de los datos de secuenciación de ARN. Como era de esperar, los transgenes humanos mostraron una fuerte expresión en sus respectivos grupos de tratamiento (Fig. 1b). Aunque se describe que la cápside ShH10 utilizada en este estudio infecta principalmente a Müller glia55, notamos niveles de expresión comparables de transgenes tanto en la retina como en el ocular, que para el transgén VEGF confirmamos mediante qRT-PCR (Fig. 4a complementaria). Para identificar los principales tipos de células que fueron transducidas por la cápside ShH10, realizamos una hibridación in situ utilizando la tecnología RNAscope en cortes transversales histológicos de ojos de ratón inyectados con AAV-VEGF, AAV-TNF-α y AAV-IL-6 (Fig. .1c). De acuerdo con la literatura55, la expresión fuerte y específica de los transgenes se limitaba a la parte interna de la retina (presumiblemente, las células ganglionares de la retina y la glía de Müller). Dado que no se observó tinción de ARNm en los ojos tratados con el control de relleno de AAV (Fig. 4b complementaria), llegamos a la conclusión de que las sondas utilizadas para detectar los tres transgenes respectivos eran específicas. Dentro del ocular, no se observó expresión de transgenes humanos en el RPE o tejido coroideo, sin embargo, notamos una fuerte expresión en el cuerpo ciliar, lo que indica que la expresión génica medida por RNA-Seq en las muestras del ocular se originó en el cuerpo ciliar (Figura 1c).

El análisis de componentes principales (PCA) indicó la mayor variación en la expresión génica entre las muestras de retina y copa ocular (Fig. 1d, panel izquierdo). Dentro del tejido de la retina, observamos una mayor separación de las muestras entre los tres grupos de tratamiento principales y los controles de relleno de AAV o los controles no inyectados (Fig. 1d, panel central y derecho). En el PCA, las muestras de los tres grupos de control aparecieron muy cerca, lo que sugiere que no hubo cambios importantes en la expresión génica causados ​​por la inyección IVT de AAV per se. Además, las muestras de AAV-TNF-α y AAV-IL-6 se agruparon y mostraron una buena separación de las muestras de control tanto en la retina como en el tejido del ocular. Sin embargo, las muestras de AAV-TNF-α mostraron una separación general más fuerte de los controles en comparación con AAV-IL-6. En el caso de AAV-VEGF, encontramos que cuatro de las muestras de retina AAV-VEGF eran claramente distintas del control y las muestras AAV-TNF-α/AAV-IL-6 (Fig. 1d). Sin embargo, las dos muestras de retina restantes (réplica 2 + 3) de ratones tratados con AAV-VEGF no mostraron separación de los controles dentro de los dos primeros componentes principales (Fig. 4c, d complementaria). De acuerdo con estos hallazgos, ambas réplicas 2 + 3 parecían normales según la FFA (Fig. 2 complementaria; Fig. 4c complementaria), lo que sugiere que la transducción del virus puede haber sido insuficiente para causar un fenotipo. A medida que observamos una expresión reducida de VEGF humano en ambas muestras (Fig. 4c complementaria), eliminamos estas dos muestras de todos los análisis posteriores.

A continuación, investigamos los genes expresados ​​​​diferencialmente (DE) en los tres grupos de tratamiento AAV-VEGF, TNF-α y AAV-IL-6 en comparación con su respectivo control de relleno de AAV, así como el relleno de AAV en comparación con no inyectado controles (Tabla complementaria S1). Como era de esperar, encontramos solo unos pocos cambios significativos en la expresión génica entre las muestras inyectadas y no inyectadas con relleno de AAV tanto para la retina como para el ocular (valor de p ajustado por BH < 0,05; Fig. 2a), lo que sugiere una vez más un impacto limitado del AAV de control inyección en la expresión génica. Observamos el mayor número de cambios de expresión significativos en el tejido de la copa del ojo transfectado con TNF-α e IL-6, mientras que AAV-VEGF afectó principalmente la expresión génica de la retina, pero no el tejido de la copa del ojo. En cada grupo de tratamiento, el transgén humano respectivo se encontraba entre los principales genes regulados al alza significativamente diferencialmente dentro de su grupo de tratamiento correspondiente, lo que valida una fuerte expresión mediada por AAV tanto en la retina como en el ocular (Fig. 2b). En los ojos inyectados con AAV-TNF-α, las moléculas de adhesión celular como Vcam1 y Madcam1 y las quimiocinas como Ccl2 se encontraban entre los genes desregulados más potentes, lo que respalda la conocida función del TNF-α en la regulación de la adhesión de las células inmunitarias a las células endoteliales56. Para confirmar los resultados de la secuenciación del ARN, la expresión de Ccl2 se validó mediante qRT-PCR, que demostró patrones de expresión similares con la expresión más alta de Ccl2 encontrada en ojos tratados con AAV-TNF-α (Fig. 4e, f complementaria). En particular, el VEGF endógeno se reguló a la baja en los ojos tratados con AAV-VEGF y el TNF-α endógeno se reguló al alza con la expresión de TNF-α o IL-6 mediada por AAV (Fig. 5 complementaria).

El análisis de expresión génica diferencial reveló cambios relacionados en los ojos tratados con TNF-α e IL-6 en comparación con VEGF. ( a ) Números de genes expresados ​​​​diferencialmente en cada tratamiento en comparación con sus respectivos controles (valor de p ajustado por BH <0.05). ( b ) Gráficos de volcán que indican los principales genes regulados diferencialmente en la retina y el tejido de la copa del ojo tras la inyección con AAV-VEGF, AAV-TNF-α o AAV-IL-6. ( c ) Diagramas de Venn que representan conjuntos de genes expresados ​​​​diferencialmente que se superponen entre grupos de tratamiento. 820 genes fueron regulados específicamente por AAV-VEGF. Gran superposición entre los genes regulados diferencialmente inducidos por TNF-α e IL-6 tanto en la retina como en el tejido de la copa del ojo. ( d ) La correlación de Spearman verificó una fuerte correlación entre los cambios de expresión génica inducidos por TNF-α e IL-6 tanto en la retina como en el tejido de la copa del ojo. El dendograma muestra un agrupamiento jerárquico y, por lo tanto, la similitud de los cambios de pliegue inducidos por el tratamiento en comparación con sus respectivos controles.

Para encontrar reguladores comunes de la enfermedad de la retina, pero también para identificar vías específicas que puedan correlacionarse con los fenotipos específicos inducidos por los tres transgenes expresados, comparamos las firmas transcriptómicas de AAV-VEGF, AAV-TNF-α y AAV-IL-6 ( Figura 2c). En general, en el tejido de la retina, solo 44 genes estaban significativamente regulados de manera diferencial en los tres grupos de tratamiento con AAV. 820 genes DE eran específicos de la retina tratada con AAV-VEGF, lo que destaca aún más una respuesta transcripcional diferente en AAV-VEGF en comparación con AAV-TNF-α y AAV-IL-6. Solo 2 genes se regularon significativamente de manera diferencial en el tejido de la copa ocular tratado con AAV-VEGF, lo que sugiere que VEGF afecta principalmente a las células de la retina en el modelo impulsado por AAV presentado. 1282 y 272 genes fueron DE en retinas transducidas con AAV-TNF-α y AAV-IL-6, respectivamente, con 133 genes superpuestos entre estos dos grupos. Además, solo 68 genes fueron regulados específicamente por AAV-IL-6, pero 966 por TNF-α en la retina, lo que sugiere que una gran parte de los cambios en la expresión génica inducidos por AAV-IL-6 estaban incluidos en AAV-TNF-α. respuesta. De acuerdo con estos resultados, la correlación más alta de cambios en los pliegues se observó entre los perfiles de expresión tratados con AAV-TNF-α y AAV-IL-6 tanto en la retina como en el tejido de la copa del ojo, mientras que AAV-VEGF parecía más distinto (Fig. 2d).

A continuación, analizamos las vías de REACTOME significativamente afectadas (prueba hipergeométrica, valor de p ajustado por BH < 0,01) por el tratamiento con AAV-VEGF, AAV-TNF-α o AAV-IL-6. Solo 1 vía se enriqueció en la retina de los tres grupos de tratamiento (Fig. 3a), a saber, "Interacciones de la superficie celular en la pared vascular" (Fig. 3b). En las retinas inyectadas con AAV-VEGF, la principal vía desregulada fue la "Organización de la matriz extracelular", mientras que AAV-TNF-α y AAV-IL-6 indujeron los cambios de expresión génica más fuertes en la vía "Interacciones inmunorreguladoras entre un linfoide y un Célula no linfoide". Entre las vías específicas de VEGF en la retina, las vías relacionadas con el colágeno y los "proteoglicanos de ECM" estaban significativamente desreguladas. Se regularon específicamente un total de 29 vías en tejido retiniano inyectado con TNF-α, por ejemplo, la vía de "Receptores similares a rodopsina de clase A 1". Dos vías se enriquecieron específicamente en muestras de AAV-IL-6: "Activación inicial del complemento" y "Creación de activadores C4 y C2". Las vías reguladas tanto por TNF-α como por IL6 incluyeron "Señalización por interleucinas" y la vía "Cascada del complemento".

El tratamiento con AAV-VEGF alteró los genes relacionados con la ECM, mientras que AAV-TNF-α y AAV-IL-6 indujeron una fuerte respuesta inflamatoria en el tejido de la retina. (a) 33 vías estaban reguladas específicamente por VEGF en la retina y la mayoría de las vías reguladas por IL-6 también estaban reguladas por TNF-α tanto en la retina como en el tejido de la copa del ojo. (b) Todas las vías de REACTOME significativamente enriquecidas (valor de p ajustado por BH < 0,01) en al menos uno de los tratamientos (AAV-VEGF, AAV-TNF-α y AAV-IL-6).

Dado que solo muy pocos genes se regularon significativamente de manera diferencial en el tejido de la copa del ojo transducido con AAV-VEGF, solo se comparó el tratamiento con AAV-TNF-α y AAV-IL-6 en el tejido de la copa del ojo (Fig. 6 complementaria). Una vez más, de manera similar al análisis de expresión génica diferencial, la mayoría de las vías identificadas en los ojos AAV-IL-6 se compartieron con AAV-TNF-α tanto en la retina como en el tejido de la copa del ojo (Fig. 6b complementaria).

La vía de la cascada del complemento está potencialmente implicada en la progresión de la enfermedad de diversas retinopatías, incluida la AMD5. Por lo tanto, analizamos los cambios en la expresión génica en esta vía con más detalle. Al comparar los tres grupos de tratamiento en ambos tejidos, se observó el mayor número absoluto de genes DE asociados con la vía REACTOME "Cascada del complemento" en el tejido de la copa ocular de los ojos tratados con AAV-TNF-α (Fig. 4a). Curiosamente, los activadores del complemento C3, Cfp y Cfb estaban fuertemente regulados al alza en AAV-TNF-α, mientras que los inhibidores del complemento como Cfh o Cfi no estaban regulados en AAV-TNF-α. Por el contrario, menos genes relacionados con el complemento fueron regulados por AAV-IL-6 e incluyeron una fuerte regulación al alza del inhibidor del complemento Cfi, lo que indica una activación nula o más leve de la vía del complemento en comparación con AAV-TNF-α. En general, estos resultados sugieren una activación de la vía del complemento en los ojos tratados con AAV-TNF-α. Uno de los genes que mostró la mayor regulación positiva en los ojos inyectados con AAV-TNF-α fue C3 tanto en la retina como en el tejido de la copa del ojo (Fig. 4b). Para validar nuestros resultados, medimos la expresión de C3 mediante ELISA en una cohorte de ratones independiente57 y verificamos la regulación positiva de también la proteína C3 a las 6 semanas después del tratamiento con AAV-TNF-α (Fig. 4c). Además, como prueba de mecanismo, el anticuerpo neutralizante de TNF-α golimumab redujo significativamente la regulación positiva de C3 mediada por TNF-α (Fig. 4c), lo que demuestra que la regulación positiva de C3 depende de TNF-α y puede revertirse en nuestro modelo .

El TNF-α indujo una fuerte regulación positiva de la vía del complemento (a) Se observó una regulación positiva de varios miembros de la vía de la cascada del complemento, especialmente en el tejido de la copa del ojo transducido con AAV-TNF-α. Los cuadrados coloreados en las columnas de la izquierda indican cambios significativos en la expresión génica con un valor P ajustado de BH < 0,05. ( b ) La expresión de C3 estaba altamente regulada en la retina y la copa ocular tratadas con AAV-TNF-α. ( c ) La proteína C3 también fue regulada positivamente por AAV-TNF-α en una cohorte de ratones independiente a las 6 semanas después del tratamiento con AAV-TNF-α y esta regulación positiva fue rescatada parcialmente por el tratamiento anti-TNF-α con golimumab (**p < 0,01 ; *p < 0,05, ANOVA de 1 vía con prueba post-hoc de Tukey; n = 3–6) medido por ELISA.

Las interacciones de la superficie celular de la integrina se encontraban entre las pocas vías que cambiaron significativamente en los grupos de tratamiento AAV-VEGF y AAV-TNF-α en la retina, por lo tanto, estábamos interesados ​​​​en qué firmas de expresión génica son comunes o diferentes entre estas dos condiciones. Dentro de la vía de interacción de la superficie celular de la integrina, observamos 4 grupos diferentes: genes que estaban regulados al alza de manera similar tanto en AAV-VEGF como en AAV-TNF-α, regulados al alza específicos de AAV-VEGF, regulados a la baja específicos de AAV-TNF-α y regulados tanto en AAV-TNF-α como en AAV-IL-6 (Fig. 5a). En la retina, varios colágenos aumentaron específicamente en ojos tratados con AAV-VEGF, mientras que AAV-TNF-α y AAV-IL-6 indujeron la expresión de genes que codifican subunidades de integrina. Curiosamente, las moléculas de adhesión celular (CAM), como Icam1, Vcam1 y Madcam1, estaban altamente reguladas al alza solo en los ojos inyectados con AAV-TNF-α (Fig. 5a, b). Madcam1 se ha relacionado previamente con TNF-α y es un actor importante en el desarrollo de enfermedades inflamatorias del intestino, pero solo unos pocos estudios describen a Madcam1 en el contexto de las retinopatías, en contraste con otras moléculas de adhesión como Vcam1. Por lo tanto, para probar si MAdCAM-1 también puede ser relevante para las retinopatías humanas, estimulamos células endoteliales microvasculares de retina humana primarias (HRMEC) con TNF-α humano recombinante. Sorprendentemente, la estimulación de TNF-α aumentó considerablemente la expresión de Madcam1 en HRMEC (Fig. 5c), lo que sugiere que MAdCAM-1 puede desempeñar un papel importante también en la retina humana y puede contribuir a la progresión de la enfermedad de varias retinopatías humanas.

Las moléculas de adhesión celular, incluida Madcam-1, se regulan específicamente al alza en los ojos tratados con AAV-TNF-α. ( a ) El patrón de expresión génica específica dentro de la ruta REACTOME "Interacciones de la superficie celular de la integrina" reveló una regulación positiva de los genes del colágeno por AAV-VEGF. Las columnas de la izquierda nuevamente indican un cambio significativo en la expresión génica con un valor de P ajustado por BH < 0.05. Los miembros de la familia de las integrinas se vieron afectados principalmente por el tratamiento con AAV-TNF-α y AAV-IL-6, pero no con AAV-VEGF. ( b ) Madcam1 fue uno de los genes más regulados al alza en los ojos inyectados con AAV-TNF-α tanto en la retina como en el tejido de la copa del ojo. ( c ) La expresión de MADCAM1 humana se regula positivamente mediante la estimulación con TNF-α de células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC, ** p <0, 01, prueba t no pareada, n = 3).

Dado que los datos de RNA-Seq a granel no resuelven la expresión génica en un nivel específico de la célula, utilizamos estudios de RNA-Seq de células individuales del RPE y retina humana recientemente publicados48,49,54 para identificar cambios específicos del tipo de célula inducidos por AAV -VEGF, AAV-TNF-α y AAV-IL-6. Para este propósito, identificamos genes marcadores específicos de células para diferentes tipos de células en los conjuntos de datos de scRNA-Seq de tejido de retina y RPE y los comparamos con los genes expresados ​​​​diferencialmente en nuestro modelo de retinopatía inducida por AAV. En el caso de los datos de RNA-Seq de células individuales de Heng, combinamos muestras de ratones de tipo salvaje y retinas Aire-/- similares a uveítis para reflejar mejor todos los tipos de células presentes en la retina sana, pero también inflamada, similar a nuestro AAV-TNF- Ojos tratados con α y AAV-IL-6. En línea con las vasculopatías observadas en los ojos tratados con AAV-VEGF, se observó un enriquecimiento significativo (prueba hipergeométrica, valor de p ajustado por BH < 0,05) de genes marcadores específicos de células endoteliales y perivasculares después del tratamiento con AAV-VEGF (Fig. 6a , panel izquierdo). En contraste, los genes específicos de monocitos / macrófagos se superpusieron significativamente con los genes DE de tejido de retina y copa ocular tratados con AAV-TNF-α y AAV-IL-6 (Fig. 6a). Curiosamente, el enriquecimiento de estas células inmunes fue más fuerte para los ojos inyectados con AAV-TNF-α en comparación con los ojos inyectados con AAV-IL-6, coincidiendo con una inflamación más severa inducida por AAV-TNF-α descrita anteriormente19. El análisis de seguimiento con un segundo conjunto de datos de scRNA-Seq49 disponible de retina humana y tejido RPE validó un enriquecimiento significativo de marcadores específicos de macrófagos/microglía en AAV-TNF-α y genes DE derivados de AAV-IL-6, así como la superposición entre genes endoteliales marcadores específicos del tipo de célula y genes DE identificados en ojos tratados con AAV-VEGF (Fig. 7a complementaria).

Los genes marcadores específicos de células endoteliales están regulados positivamente por VEGF y los genes específicos de células T por TNF-α. ( a ) La expresión de VEGF indujo la regulación positiva de los genes marcadores específicos de células endoteliales y perivasculares en el tejido de la retina. Tanto la expresión de TNF-α como de IL-6 indujo un enriquecimiento de genes específicos de macrófagos/monocitos. Solo TNF-α indujo una regulación positiva significativa de genes específicos de células B y T en la retina. ( b ) El mapa de calor de genes específicos de células T significativamente desregulados en cualquier tratamiento demostró una fuerte regulación positiva de estos genes por AAV-TNF-α. ( c ) La tinción de inmunofluorescencia con el marcador de células pan-T CD3 reveló infiltración de células T en ojos inyectados con AAV-TNF-α (verde = CD3, azul = DAPI). Tenga en cuenta el aumento del grosor de la retina y la desorganización de las capas de la retina en los ojos tratados con AAV-TNF-α.

Los cambios de expresión de los genes marcadores específicos del tipo de célula relevantes identificados (células endoteliales vasculares, monocitos) fueron en su mayoría positivos (Fig. 7b, c complementaria), lo que sugiere un aumento general de estos tipos de células con el tratamiento AAV respectivo. Nuestro análisis de enriquecimiento indicó además la regulación positiva más fuerte de los genes marcadores específicos de células T en las retinas TNF-α (Fig. 6a, b). Hicimos un seguimiento de esta observación mediante el análisis histológico de las secciones transversales de la retina y, de hecho, validamos que las células que expresaban el marcador de células pan-T CD3 estaban presentes en los ojos inyectados con AAV-TNF-α (Fig. 6c), lo que sugiere que las células T la infiltración es inducida por AAV-TNF-α.

Un modelo animal utilizado con frecuencia para las retinopatías proliferativas es el modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR), que presenta tanto neovascularización como neurodegeneración. Los ratones recién nacidos se exponen a un 75 % de oxígeno desde el día 7 al 12 posnatal y, a partir de entonces, vuelven al aire ambiente (21 % de oxígeno) hasta el día 17. En el día 7, la vasculatura retiniana de las crías de ratón aún es inmadura y vulnerable a las condiciones de alto oxígeno. La pérdida de capilares en el centro de la retina conduce a la formación de un área avascular. Al regresar al aire ambiente en el día 12, el área se vuelve hipóxica y se ha demostrado que la expresión de VEGF dependiente de Hif1α desencadena la angiogénesis, alcanzando un máximo en P1711,12. Debido a la hipoxia, también se observa apoptosis de neuronas y adelgazamiento de la retina en el área avascular en este modelo58. Para comprender mejor los cambios en el transcriptoma inducidos por AAV-VEGF, TNF-α e IL-6, nuestro objetivo fue comparar el transcriptoma de las retinas transducidas por AAV con las retinas OIR. Primero, observamos los cambios en el transcriptoma inducidos en el modelo OIR en comparación con los controles en el día 12 postnatal (P12), P13, P14, P15 y P16. PCA demostró una clara separación entre el modelo OIR y los controles (Fig. 7a). Sorprendentemente, también los cambios dependientes del tiempo en el transcriptoma de los ratones de control y OIR fueron claramente visibles en el PCA (Fig. 7a). La mayor cantidad de genes expresados ​​​​de manera significativamente diferencial (valor p ajustado por BH <0.05) se detectó en P12 (10,855), poco después de que los ratones fueran retirados de la cámara hiperóxica (Tabla complementaria S2). En puntos de tiempo posteriores, la cantidad de genes expresados ​​​​diferencialmente disminuyó a alrededor de 3000 a 7000 genes entre P13 y P16 (Fig. 7b), lo que sugiere una respuesta transitoria directamente después del final del tratamiento hiperóxico (P12). Como era de esperar, comenzando en P13 al inicio de la hipoxia en el área avascular, la expresión endógena del factor Vegf de ratón dependiente de Hif1a aumentó gradualmente con el tiempo (Fig. 8a complementaria), similar a estudios previos43,59. No se detectó la expresión de Il6, mientras que la expresión de TNF-α alcanzó su punto máximo en P13 y 14 (Fig. 8b complementaria), lo que sugiere un componente inflamatorio temprano en el modelo OIR.

La firma transcriptómica del tratamiento con AAV-VEGF es muy similar a la observada en ratones P16 OIR. (a) PCA demostró una separación clara de las muestras según el tratamiento (normoxia frente a hipoxia) y el punto de tiempo. ( b ) La mayor cantidad de cambios en la expresión génica se observó en P12 y P13 y la cantidad de genes regulados diferencialmente se estabilizó en 3000–5000 genes en P14-P16. ( c ) El enriquecimiento más fuerte para un patrón de expresión génica similar se observó entre OIR P16 y AAV-VEGF (enriquecimiento de 2,2 veces). ( d ) La superposición entre los genes DE de AAV-VEGF, AAV-TNF-α, AAV-IL6 y el modelo OIR (P16) se representan en el diagrama de Venn. ( e ) Los genes expresados ​​​​específicamente por las células endoteliales se regularon al alza en los ojos inyectados con AAV-VEGF y la retina P15 / P16 OIR, pero no la retina P12 / P13 OIR.

Al comparar los tres modelos de ratón AAV y OIR, observamos una superposición significativa de genes expresados ​​​​diferencialmente (prueba hipergeométrica, valor de p ajustado por BH <0.01) en la retina OIR en comparación con los identificados en el modelo AAV-VEGF (Fig. 7c, d). El mayor enriquecimiento de genes DE se encontró entre los ratones AAV-VEGF y el modelo OIR en P16, que es el momento pico del fenotipo vascular en el modelo OIR. La integración de los conjuntos de datos de células individuales descritos anteriormente48,54 demostró que, entre otros, también los genes marcadores específicos de células vasculares se enriquecieron en el conjunto de datos OIR (Fig. 8c complementaria) similar a los datos AAV-VEGF. Sorprendentemente, la mayoría de los genes específicos de células endoteliales se regularon inicialmente a la baja en los primeros puntos de tiempo de OIR y luego se regularon al alza a partir de P15, similar a AAV-VEGF (Fig. 7e). Por el contrario, los genes DE identificados a partir del modelo de ratón OIR en etapa tardía, pero no los identificados a partir de AAV-VEGF, se superpusieron significativamente con genes expresados ​​específicamente en células bipolares. Llegamos a la conclusión de que los tipos de células endoteliales vasculares y perivasculares se ven afectados por el tratamiento con AAV-VEGF (Fig. 6a) y los tipos de células adicionales se ven afectados en el modelo OIR debido a la desnutrición y la isquemia inducida en este modelo.

Finalmente, nuestro objetivo fue comprender qué vías se vieron afectadas en los modelos de retinopatía impulsados ​​​​por AAV-VEGF en comparación con el modelo OIR (Fig. 8d complementaria). Curiosamente, múltiples vías relacionadas con la matriz extracelular se enriquecieron en genes DE identificados a partir del modelo AAV-VEGF o OIR, lo que sugiere cambios similares en ambos modelos. Una vez más, la "Organización de la matriz extracelular" apareció como una de las vías desreguladas más fuertes tanto en AAV-VEGF como en OIR P16. Curiosamente, los genes relacionados con la señalización neuronal se enriquecieron entre las vías específicas de OIR, mientras que las vías específicas de AAV-VEGF incluían vías involucradas en las interacciones de la superficie celular. En conjunto, nuestro análisis reveló similitudes pero también diferencias entre los cuatro modelos de ratón diferentes para retinopatías y, por lo tanto, es un recurso valioso para que los investigadores identifiquen el modelo animal más apropiado con respecto a su tema de investigación preclínica.

En este estudio, medimos los cambios en el transcriptoma inducidos por AAV-VEGF, AAV-TNF-α y AAV-IL-6 y comparamos estos cambios de expresión entre sí y con los cambios de expresión génica observados en el modelo OIR bien establecido. Nuestro objetivo era comprender mejor los posibles mecanismos moleculares que contribuyen a las patologías de la retina, pero también aumentar nuestra capacidad para seleccionar los modelos animales apropiados para cada patología.

Los AAV se han convertido en una herramienta útil para generar rápidamente nuevos modelos animales que permiten un alto grado de flexibilidad con respecto al tiempo y la expresión específica de tejido. En nuestro estudio, elegimos la cápside ShH10 para la expresión de los tres transgenes humanos. Incluso a escala global, medido a través de un método de alto rendimiento como RNA-Seq, la inyección de la cápside de control (1 × 108 o 1 × 109 VG/ojo) en ojos de ratón con una secuencia biológicamente inactiva produjo muy poca expresión génica. cambios. La expresión mediada por AAV de hTNF-α, hIL-6 o hVEGF condujo a una alta expresión de estos transgenes humanos, lo que a su vez produjo cambios fuertes y distintos en el transcriptoma. Aunque los errores de medición en RNA-Seq causados ​​por la presencia simultánea de versiones humanas y murinas del transgén expresado por AAV son teóricamente posibles, no esperamos grandes errores de cuantificación, ya que los transgenes humanos tienen codones optimizados y poseen una etiqueta V5, por lo que son suficientemente diferente a su secuencia de transcripción endógena. Además, no observamos ninguna reducción en el porcentaje de lecturas mapeadas de forma única en presencia de transgenes expresados ​​en AAV (datos no mostrados).

De acuerdo con la literatura actual, ShH10 infecta principalmente a Müller glia55, que abarca anatómicamente la retina completa con sus procesos, lo que permite la secreción de VEGF, TNF-α e IL-6 en toda la retina. El análisis de RNAscope indicó la expresión de transgenes humanos dentro de la capa RGC y la capa nuclear interna, que potencialmente se derivan de la glía de Müller. Además, el análisis de RNAscope demostró una fuerte expresión de los tres transgenes en el cuerpo ciliar, lo que explica por qué se detectaron altos niveles de expresión de los transgenes en el análisis de RNA-Seq del tejido de la copa del ojo disecado, incluido el cuerpo ciliar. La fuerte expresión de transgenes humanos en el cuerpo ciliar también podría explicar el crecimiento de tejido endotelial alrededor del cuerpo ciliar en las áreas periféricas de la retina en ojos inyectados con AAV-VEGF19. Curiosamente, en el artículo original que describe la cápside ShH10, la inyección IVT de ShH10-GFP condujo a una fuerte expresión de GFP en la glía de Müller, así como en el cuerpo ciliar, pero este hallazgo no se discutió más55. Mientras tanto, otros investigadores han investigado las cápsidas de AAV con buena eficiencia de transducción del cuerpo ciliar para el tratamiento del glaucoma y encontraron que la cápside ShH10 es más adecuada para transducir el cuerpo ciliar en comparación con las cápsidas de AAV1, AAV2, AA5 y AAV660. Si bien la transducción del cuerpo ciliar puede ser deseable para ciertas aplicaciones, puede ser necesaria una expresión estrictamente específica del tipo de célula, por ejemplo, para enfoques de terapia génica que administran proteínas intracelulares. Para los factores secretados, como VEGF, TNF-α e IL-6, es posible que no se requiera la expresión específica del tipo de célula. Sin embargo, seguirá siendo interesante en el futuro probar otras cápsidas para expresar VEGF, TNF-α e IL-6 en la retina y comparar los fenotipos logrados por diferentes tropismos celulares. Por lo tanto, concluimos que se debe hacer una selección cuidadosa de la cápside para cada aplicación.

En nuestro análisis, los genes significativamente cambiantes presentes en la cascada del complemento se regularon fuerte y específicamente en los ojos inyectados con AAV-TNF-α. Entre ellos, el factor C3 de la vía del complemento fue uno de los genes regulados positivamente más fuertes en los ojos inyectados con AAV-TNF-α. C3 juega un papel central en la activación de la vía clásica y alternativa del complemento y las mutaciones en C3 y otros miembros de la cascada del complemento se correlacionan con un mayor riesgo de AMD61,62,63 y uveítis64. Además, se sabe que C3 está regulado al alza en la retina de los pacientes con DMAE65,66, así como en el humor vítreo, acuoso y sérico de los pacientes con uveítis67,68,69, por lo que dirigirse al sistema del complemento presenta un enfoque atractivo para tratar las retinopatías70. En consecuencia, el tratamiento anti-C3 y anti-C5 se evalúa actualmente en ensayos clínicos de última etapa para la atrofia geográfica (AG) secundaria a AMD71,72. En el pasado, los animales transgénicos que modifican la expresión de genes del complemento, o los ratones que expresan variantes humanas de genes relacionados con el complemento, han demostrado ser extremadamente útiles para comprender su contribución a la progresión de la enfermedad65,73,74,75,76,77,78. Para seguir desarrollando terapias novedosas y eficaces, se necesitan modelos animales con una activación robusta de la vía del complemento. En el modelo de uveítis inducida por LPS, los genes relacionados con el complemento, incluido C3, están regulados al alza39, lo que sugiere la activación del complemento. De manera similar, la uveítis autoinmune experimental (EAU) conduce a la activación del sistema del complemento y el bloqueo del sistema del complemento mejora la patología de la enfermedad79. La activación del sistema del complemento también es visible en el modelo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser, y la inhibición de varios factores del complemento tuvo efectos beneficiosos80,81,82. Sin embargo, tanto los modelos experimentales de uveítis como el modelo láser de CNV son transitorios y solo permiten investigaciones a corto plazo. Por el contrario, en el modelo AAV-TNF-α presentado, C3 mostró una regulación positiva fuerte y sostenida a las 3 y 6 semanas después de la inyección IVT de AAV-TNF-α, lo que permitió estudios a largo plazo del sistema del complemento. Además, como prueba del mecanismo, demostramos que el tratamiento con el anticuerpo neutralizante anti-TNF-α golimumab reduce la expresión de C3, lo que demuestra que la activación del complemento es reversible en nuestro modelo. En resumen, el modelo de ratón inducido por AAV-TNF-α proporciona una herramienta valiosa para estudiar el papel del sistema del complemento en la progresión de la enfermedad, con expresión a largo plazo de TNF-α y C3, que es comparable a la patología humana que se desarrolla durante décadas. .

Además de C3, las moléculas de adhesión celular (CAM), como Icam1, Vcam1 y Madcam1, estaban altamente reguladas al alza en ojos inyectados con AAV-TNF-α, lo que fortalece la observación previa de infiltración de células inmunitarias y vasculitis en ojos inyectados con AAV-TNF-α por histología19. MAdCAM-1 es inducida por TNF-α en diversas células endoteliales y recluta células T para tejidos inflamados83,84,85 y, por lo tanto, recientemente se ha identificado como un objetivo interesante para tratar enfermedades inflamatorias intestinales86. Además de la regulación positiva de Madcam1, observamos la infiltración de células T en nuestro modelo similar a la uveítis impulsado por AAV-TNF-α, en línea con el papel bien descrito de las células T en pacientes con uveítis y modelos de roedores con uveítis87,88. Aunque existe un interés general en el papel del TNF-α y las CAM en el contexto de las retinopatías, hasta donde sabemos, solo existe un estudio reciente de Peng et al. demostrando una función directa para Madcam1 murino en la degeneración retiniana83. De acuerdo con Peng et al., Demostramos una regulación positiva de Madcam1 en ojos inyectados con AAV-TNF-α que se correlaciona con una invasión de células T. Ampliando esta observación, demostramos que MAdCAM-1 también está regulado al alza en HRMEC estimulados por TNF-α, lo que sugiere que la regulación de MAdCAM-1 inducida por TNF-α también puede ser relevante en las células de la retina humana.

Para comprender mejor las diferencias entre varios modelos de enfermedad de retinopatía, comparamos los perfiles de expresión génica de los modelos de retinopatía impulsados ​​por AAV generados con los datos de RNASeq del modelo OIR de uso frecuente11,12. Para capturar la dinámica de expresión transitoria presente en el modelo OIR, recolectamos ojos de ratón en 5 puntos de tiempo posteriores después del tratamiento hiperóxico. De hecho, otros autores han realizado análisis de la expresión del gen OIR, sin embargo, muchos estudios se basaron en datos de micromatrices que solo evaluaron parte del transcriptoma en contraste con el análisis completo del transcriptoma presentado aquí. Por otro lado, los estudios OIR RNA-Seq incluyeron un muestreo menos denso de puntos de tiempo en comparación con nuestro estudio, en el que brindamos información más detallada sobre los cambios de expresión génica dependientes del tiempo. El estudio de Yang et al.46 se centró en los cambios en la expresión génica durante y poco después del tratamiento hiperóxico, mientras que nuestro estudio se centró principalmente en los cambios en la expresión génica después del regreso a las condiciones normóxicas y en una comparación detallada con los cambios en la expresión génica inducidos por AAV. Sin embargo, observamos firmas de expresión génica compartidas de genes clave entre los dos estudios, por ejemplo, VEGF y el gen Edn2 estaban regulados al alza en P13.

Es bien sabido que VEGF es un importante impulsor del modelo OIR y el tratamiento anti-VEGF previene la neovascularización en el modelo OIR17,24. Por lo tanto, como se esperaba, los genes DE en el modelo AAV-VEGF mostraron la mayor superposición con los identificados en el modelo OIR. Mediante la integración de los datos de expresión de RNA-Seq de una sola célula, mostramos que dentro del curso de tiempo medido para el modelo OIR, los genes específicos de células endoteliales primero se regularon a la baja y luego se regularon al alza a partir de P15. Además, otros estudios han encontrado una regulación a la baja de genes relacionados con la angiogénesis como CD34 en el modelo OIR en P12, mientras que genes específicos de células endoteliales como Esm1 o Edn2 estaban regulados al alza en P1789. Esm1 es un gen bien conocido inducido por VEGF en células tip con un papel crucial en la angiogénesis y su bloqueo inhibe la neovascularización de diversos modelos de neovascularización en roedores, incluidos el OIR, el láser CNV y el ratón transgénico rho/VEGF90,91. En consecuencia, también observamos una regulación positiva del gen Esm1 tanto en el conjunto de datos OIR como en el modelo impulsado por AAV-VEGF, que se parece mucho al fenotipo de neovascularización observado. Dado que proporcionamos una alta resolución temporal de los cambios de expresión génica en el modelo OIR, pudimos identificar el cambio entre la regulación negativa y positiva de los genes específicos de células endoteliales a P14. Estos cambios en la expresión génica encajan muy bien con los cambios fenotípicos presentes en el modelo OIR, donde en P12 se altera el desarrollo de la vasculatura y hay áreas avasculares, y más tarde, la neovascularización alcanza su punto máximo alrededor de P1792,93.

Aunque muchas vías, incluidas las vías relacionadas con ECM y las respuestas específicas de células endoteliales, fueron similares entre el modelo OIR y los ratones tratados con AAV-VEGF, también observamos diferencias entre estos modelos de enfermedades: por ejemplo, en el modelo OIR, pero no en AAV-VEGF, las vías de señalización neuronal y los genes relacionados con la sinapsis se enriquecieron significativamente para los genes DE. De acuerdo con esta observación, observamos una superposición significativa de genes específicos de células neuronales (por ejemplo, células bipolares, RGC) y genes DE identificados en el modelo OIR. Para el modelo OIR se utilizan crías de edades P12 a P17, un punto de tiempo que corresponde a un punto de tiempo en el que las redes vasculares y neuronales aún se están desarrollando en la retina murina94,95. Además, se ha observado muerte neuronal y disminución de la función retiniana en el modelo OIR96,97, probablemente debido a la isquemia y desnutrición inducida por la hipoxia. En consecuencia, el modelo OIR ha sido discutido como el modelo más apropiado para la retinopatía del prematuro (ROP)93, una enfermedad que afecta a los bebés prematuros humanos. Si bien se necesitan cachorros de ratón muy jóvenes para el modelo OIR, los ratones viejos o diabéticos pueden combinarse con la sobreexpresión de AAV de transgenes humanos, para reflejar más de cerca las retinopatías humanas relacionadas con la edad o asociadas con la diabetes, como AMD o DR en el futuro.

A pesar de nuestros esfuerzos para garantizar un diseño experimental óptimo, se aplican ciertas limitaciones, sobre todo porque los conjuntos de datos de secuenciación AAV y OIR se generaron en experimentos independientes. Además, también desde una perspectiva biológica, los modelos difieren, ya que el modelo OIR utiliza crías de ratón muy jóvenes durante el desarrollo, en contraste con nuestros modelos inducidos por AAV que se desarrollaron con ratones adultos. Mientras que en el estudio OIR se incluyeron 3 o 4 muestras en cada punto de tiempo, el estudio AAV se realizó con 5 o 6 réplicas por grupo. Además, la preparación y secuenciación de bibliotecas dependía de diferentes protocolos. Para paliar estas limitaciones, nuestro análisis se basa en cambios de pliegue relativos entre el tratamiento y los controles respectivos, en lugar de valores de expresión absolutos, lo que explica las diferencias en la preparación de bibliotecas.

En conjunto, aquí caracterizamos los perfiles de expresión génica de modelos de ratón con retinopatía impulsada por AAV-VEGF, TNF-α o IL-6, y combinamos estas mediciones con datos de expresión de ARN de células individuales disponibles públicamente. Nuestro estudio brinda información única sobre los cambios moleculares y específicos de las células que conducen a las patologías de la retina, por lo que descubre nuevas opciones de tratamiento potenciales para las enfermedades de la retina y, al mismo tiempo, ofrece los medios para probarlas en un modelo de enfermedad estable comparable a la patología humana. Al medir aún más los cambios en la expresión génica en el modelo OIR bien establecido, comparamos modelos animales nuevos y establecidos para retinopatías y brindamos a los investigadores información importante que guía la decisión de qué modelo animal se adapta mejor a la necesidad de un determinado proyecto de investigación preclínica.

Se adquirieron ratones C57BL/6 J de Charles River (Sulzfeld, Alemania). Se utilizaron ratones macho de 6 a 8 semanas de edad para el estudio de AAV. Se compraron hembras preñadas para el estudio OIR y se usaron cachorros macho y hembra en P12 para los experimentos OIR. Los ratones se alojaron en jaulas ventiladas individualmente en grupos de 2 a 5, temperatura constante y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los ratones tenían acceso ad libitum a comida y agua estándar para roedores. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley alemana de bienestar animal, las directrices de la Federación de la Asociación Europea de Ciencias de los Animales de Laboratorio (FELASA), las directrices ARRIVE y fueron revisados ​​y aprobados por el organismo gubernamental responsable del bienestar animal en el estado de Baden. Wurtemberg (Regierungspräsidium Tübingen, Alemania).

Se generaron plásmidos con el ubicuo promotor CAG que codifican tres transgenes humanos con codones optimizados (VEGF-A 165, TNF-α e IL-6) que tienen una secuencia etiqueta V5 en el extremo 3' del gen que se generaron previamente19. La construcción de control de relleno de AAV incluye una secuencia no codificante de la UTR 3' del gen UBE3A y se ha descrito en otra parte (Strobel 2015). Los AAV utilizados en este estudio se empaquetaron en la cápside ShH10 (Klimczak 2009). La producción y cuantificación de AAV por PCR cuantitativa se realizó de acuerdo con protocolos publicados previamente (Strobel 2019). Las siguientes secuencias optimizadas por codones humanos se incluyeron en cada uno de los AAV recombinantes:

AAV-hIL6—.

AAV-hTNFa—.

AAV-hVEGF—.

A los ratones se les inyectaron por vía intravítrea los diferentes AAV bajo anestesia con isoflurano y después se aplicaron colirios anestésicos locales (Novesin, OmniVision). Ambos ojos de 6 ratones por grupo fueron inyectados con 1 × 108 genomas virales (VG)/ojo (dosis baja) o 1 × 109 VG/ojo (dosis alta) en 1 µL de tampón AAV. Tenga en cuenta que AAV-VEGF se inyectó a una concentración de 1 × 108 VG/ojo y AAV-TNF-α y AAV-IL-6 a 1 × 109 VG/ojo con controles de relleno de AAV correspondientes. En una cohorte de ratones independiente, 2 semanas después del tratamiento con AAV-TNF-α, se inyectó IVT en los ojos con 1 µL de vehículo o anti-TNF-α Golimumab neutralizante (100 mg/mL, Simponi, 4,223,913, Komtur Apotheke). Si fallaba la inyección IVT (p. ej., debido al daño de un vaso sanguíneo importante o del cristalino), el ojo se excluía del análisis.

Las imágenes in vivo se realizaron como se describió anteriormente19. En resumen, los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal con 60 a 90 mg/kg de ketamina (Medistar) y 6 a 8 mg/kg de xilazina (Rompun, Bayer). Las pupilas se dilataron con tropicamida 5 mg/mL (Mydrum, Bausch + Lomb) y fenilefrina (Neosynephrin-POS 10%, Ursapharm). Se utilizó un dispositivo Spectralis HRA/OCT (Heidelberg Engineering) equipado con una lente de campo amplio de 55° para registrar imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) e imágenes de autofluorescencia (AF). Para la angiografía con fluoresceína de fondo de ojo (FFA), se inyectaron subcutáneamente 200 µl de una solución de fluoresceína al 0,2 % (Alcon) y se registraron 90 s después de la inyección con Spectralis HRA/OCT (Heidelberg Engineering). Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Se disecaron la retina y la copa del ojo (incluidos el RPE, la coroides, la esclerótica y el cuerpo ciliar) y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido.

Los experimentos OIR se realizaron de acuerdo con protocolos previamente publicados (Smith et al.11). En resumen, se transfirieron cachorros machos y hembras de 7 días de edad con sus madres a una cámara hiperóxica (75% de oxígeno). En P12, la concentración de oxígeno se redujo lentamente a condiciones normóxicas (21% de oxígeno) en aproximadamente 3 h. Los ratones de control permanecieron en condiciones normóxicas durante todo el experimento. Los ratones fueron sacrificados en P12, P13, P14, P15 y P16 por dislocación cervical. Las retinas diseccionadas se almacenaron en RNAlater (Invitrogen).

Se homogeneizaron tejidos de copa ocular y retina diseccionados ultracongelados (n = 72) en 700 µl de Qiazol (Qiagen) usando un homogeneizador Precellys Evolution (Bertin Technologies). Las muestras de retina se homogeneizaron con perlas de cerámica (MPbio, 6913-500) y las muestras de copa ocular con perlas de metal (Bertin Technologies, 15,987,602) y se procesaron en 4 lotes separados. El ARN total se extrajo con el miRNeasy Micro Kit (Qiagen, 217,084) de acuerdo con el protocolo de tejido del fabricante, incluido el tratamiento con DNasa en columna (Qiagen, 79,254). Las muestras de ARN total (36 oculares, 36 de retina) se evaluaron cuantitativa y cualitativamente utilizando el kit de ensayo de ARN Quant-iT de rango amplio basado en fluorescencia (Thermo Fisher Scientific) y el kit de análisis de ARN de sensibilidad estándar DNF-471 en un fragmento de 96 canales Analizador (Agilent), respectivamente. Las concentraciones promediaron 48,7 ng/µL mientras que el RIN osciló entre 5,2 y 9,6, con una mediana de 9,2. Dos muestras con RIN por debajo de 6 se excluyeron del procesamiento posterior: AAV-relleno (alto) copa ocular réplica 4 y AAV-VEGF copa ocular réplica 5. Consulte la Tabla 1 para obtener un resumen de todas las muestras en el estudio AAV.

Las retinas se diseccionaron de ratones C57BL/6 J postnatales de 12 a 16 días (n = 32). Los tejidos conservados con RNAlater se rompieron y homogeneizaron en tubos CK14 (VWR, 10144-496) con tampón RLT usando un homogeneizador Precellys Evolution (Bertin Technologies). A continuación, se extrajo el ARN total utilizando el kit de aislamiento de ARN total MagMAX-96 (Thermo Fisher Scientific, AM1830) que incluía una digestión con ADNasa antes de la elución final (Qiagen, 79254). Las muestras de ARN total se evaluaron cuantitativa y cualitativamente en un lector de microplacas Synergy con un módulo Gen5 Take3 (BioTek) y el chip microfluídico Eukaryote total RNA 6000 Nano (Agilent, 5067-1511) en un sistema 2100 Bioanalyzer (Agilent), respectivamente. Las concentraciones promediaron 136,3 ng/µl, mientras que el RIN de las muestras seleccionadas estuvo por encima de 8,4. Todas las muestras se procesaron adicionalmente para la preparación de la biblioteca. Consulte la Tabla 2 para obtener un resumen de todas las muestras del estudio OIR.

Se normalizaron 70 muestras de ARN derivadas de retina y copa ocular en la plataforma líquida automatizada MicroLab STAR (Hamilton). Se utilizó una entrada de ARN total de 250 ng para la construcción de bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II para Illumina n.° E7760, junto con el módulo de aislamiento magnético de ARNm NEBNext Poly(A) n.° E7490 aguas arriba y NEBNext Multiplex Oligos para Illumina n.° E7600 aguas abajo (todos los Biolabs de Nueva Inglaterra). La única desviación del protocolo del fabricante fue el uso de perlas Ampure XP (Beckman Coulter) para la purificación de ADNc de doble cadena, en lugar de las perlas SPRIselect recomendadas. La PCR índice se realizó con 12 ciclos, mientras que la biblioteca final se eluyó en 35 µL. A continuación, las bibliotecas de ARNm se cuantificaron mediante el kit de ensayo Quanti-iT de ADNds de alta sensibilidad (ThermoFisher) en un Synergy HTX (BioTek). La molaridad de la biblioteca promedió 149 nM. También se evaluó la distribución de tamaños de las bibliotecas de ARNm (análisis de frotis de un promedio de 360 ​​pb) y la presencia de dímero adaptador (< 0,5 %) mediante el kit DNF-477 de fragmentos pequeños de alta sensibilidad en un analizador de fragmentos de 96 canales (Agilent). Las 70 bibliotecas de secuenciación se normalizaron luego en MicroLab STAR (Hamilton), se agruparon y se añadieron con PhiX Control v3 (Illumina). Posteriormente, el grupo de bibliotecas se agrupó en una celda de flujo S4 y se secuenció en un sistema de secuenciación NovaSeq 6000 (Illumina) con índice dual, lecturas emparejadas de 2 × 100 pb de longitud (parámetros de lectura: Rd1: 101, Rd2: 8, Rd3: 8, Rd4: 101), alcanzando una profundidad promedio de 31,3 millones de lecturas de Pass-Filter por muestra (7,0% CV). La descripción de la preparación y secuenciación de la biblioteca de ARN se alinea estrechamente con la proporcionada por Becker et al.36.

Se usó una entrada de ARN total de 100 ng para la construcción de bibliotecas con el kit TruSeq Stranded mRNA LT: conjunto A (Illumina, RS-122-2101), junto con SuperScript II Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, 18064014), según las instrucciones del fabricante. protocolo. La calidad de las bibliotecas de ARNm se evaluó en cuanto a la presencia de adaptadores y heterodímeros con el chip microfluídico DNA 1000 (Agilent, 5067-1504), mientras que la molaridad de la biblioteca se midió con el kit de ensayo Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, P11496). Luego, las 32 bibliotecas de secuenciación se normalizaron, agruparon y agregaron con PhiX Control v3 (Illumina). Posteriormente, el grupo de bibliotecas se agrupó con TruSeq SR Cluster Kit v3 (Illumina, GD-401-3001) y se secuenció con reactivos TruSeq SBS Kit v3 (Illumina, FC-401-3002) en un sistema de secuenciación HiSeq 2000 (Illumina) con índice único, lecturas de lectura única a una longitud de 1 × 51 pb (parámetros de lectura: Rd1: 52, Rd2: 7), alcanzando una profundidad promedio de 24,9 millones de lecturas de filtro de paso por muestra (13,1 % CV).

Se cultivaron células endoteliales microvasculares primarias de la retina humana (HRMEC, ACBRI 181, Cell Systems Corporation) en medio de crecimiento de células endoteliales (C-22010, Promocell) en placas recubiertas previamente con gelatina al 0,1 % (ES-006-B, Millipore). Las células se cultivaron en una cámara humidificada a 37 °C y 5 % de CO2. El contador de células LUNA-FL (LogosBio) con colorante naranja de acridina (F23002, LogosBio) se utilizó para la cuantificación celular antes de la siembra. Los HRMEC se estimularon con 10 ng/ml de TNF-α humano recombinante (210-TA-005, RnD Systems) durante 24 ha 37 °C. Las células se lavaron con PBS y se lisaron en tampón RLT proporcionado por Qiagen y se extrajo el ARN usando el RNeasy Mini Kit (74106, Qiagen) de acuerdo con el manual del fabricante.

La síntesis de ADNc se realizó con el kit de ADNc de alta capacidad (4368814, Applied Biosystems) y la qRT-PCR se realizó con Taqman Universal PCR Master Mix (4304437, Applied Biosystems) en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 (Applied Biosystems). La expresión relativa (inducción de veces) se calculó usando el método ΔΔCT y los genes 18S (para tejido de ratón) y POLR2A (para HRMEC) se usaron como controles de normalización. En este estudio se utilizaron las siguientes sondas Taqman: 18S (Hs99999901_s1), POLR2A (Hs00172187_m1), Madcam1 (Hs00369968_m1), CCL2 (Mm00441242_m1) y una sonda Taqman personalizada que detecta VEGF optimizado por codón humano con una etiqueta V5 (cebador fwd 5ʹ - ACTGAACGAGAGAACCTGCA -3ʹ, cebador rev 5ʹ GCCCAGCAGAGGATTAGGAA-3ʹ, sonda 5ʹ- CTAGAAGAGAGGTGGCG-3ʹ).

Los ojos para la validación de la expresión de C3 se generaron a partir de una cohorte de ratones independiente que se publica en otro lugar57. En resumen, 2 semanas después de la inyección IVT de AAV-TNF-α, se inyectaron intravítreamente 100 µg de golimumab (Simponi). 6 semanas después de la inyección de AAV, se enuclearon ojos completos, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se homogeneizaron en tampón de lisis (9803, Cell Signalling) complementado con inhibidor de proteinasa Pefabloc SC (76307-100MG, Sigma) con perlas de metal (15987602, Bertin Technologies) en un homogeneizador de tejidos Precellys Evolution (Bertin Technologies). La expresión de C3 se midió con el kit Mouse C3 SimpleStep ELISA (ab26388, Abcam) según el protocolo del fabricante y se midió con un lector de placas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices).

Los ojos para el análisis histológico se generaron en un experimento independiente que se publicó en otra parte19. Los ojos se enuclearon de 3 a 6 semanas después de la inyección de IVT y se fijaron directamente en paraformaldehído al 4 % (AR1068, Boster) durante 48 h a 4 °C. Los ojos se deshidrataron, se incubaron en xilol y se infiltraron con parafina usando una máquina de procesamiento de tejidos (Tissue-Tek VIP 6, Sakura). Las tinciones inmunohistoquímicas se realizaron en secciones de 3 µm con el Opal Multiplex IHC Kit (Akoya Biosciences) y se llevaron a cabo en la plataforma automatizada Leica Bond (Leica Biosystems, Melbourne, Australia). La recuperación del antígeno se realizó con BOND Epitope Retrieval Solution 1 (35608, Leica Biosystems, Melbourne, Australia) a 95 °C y pH 6,0 durante 20 min. El anticuerpo policlonal de conejo anti-CD3 (ab5690, Abcam) se diluyó 1:200 y se utilizó como marcador pan-células T. El anticuerpo secundario anti-HRP de conejo de polímero OPAL (ARR1001KT, Akoya Biosciences) y el reactivo OPAL 570 (FP1488001KT, Akoya Biosciences) se utilizaron para desarrollar la señal fluorescente. Los núcleos se tiñeron con DAPI espectral (FP1490, Akoya Biosciences) y los portaobjetos se montaron con ProLong Antifade Mounting Medium (P36961, Invitrogen). Se tomaron imágenes de las tinciones de inmunofluorescencia utilizando un microscopio de escaneo láser LSM700 (objetivo 20 ×, Carl Zeiss Microscopy GmbH). Las hibridaciones in situ de RNAscope para VEGF, TNF-α e IL-6 humanos se realizaron externamente en ACDBio/Biotechne utilizando el ensayo RNAscope 2.5 LSx Red. Se diseñaron sondas personalizadas en función de los transgenes humanos etiquetados con V5 optimizados por codón expresados ​​por cada AAV. Como controles técnicos se utilizaron las sondas ACD Positive Control (Mm-Ppib, 313918, ACDBio) y ACD Negative Control (dapB, 312038, ACDBio). La recuperación del epítopo se realizó durante 15 min a 88 °C y la proteólisis con Proteasa III durante 15 min a 40 °C en ACDBio. Se tomaron imágenes de las diapositivas utilizando un escáner de diapositivas AxioScan.Z1 (objetivo 20 ×, Carl Zeiss Microscopy GmbH).

En el caso del conjunto de datos OIR, se usó GRCm38.96 como genoma de referencia. Para el estudio de AAV, se creó un genoma personalizado fusionando secuencias optimizadas de codones para hIL6, hTNFa y hVEGF en el genoma del ratón. La generación de índices genómicos y la alineación de lectura se realizó a través de STAR (versión 2.5.2b). La cuantificación a nivel de genes se realizó utilizando FeatureCounts (versión 1.5.1) y RSEM (versión 1.3.0), mientras se descartaban las lecturas de mapeo múltiple. Las métricas de control de calidad se obtuvieron utilizando MultiQC (versión 1.0), con información recopilada de STAR, picardmetrics (versión 0.2.4) y fastQC (versión 0.11.5), entre otras fuentes.

Los genes con un valor de recuento de lectura inferior a 10 en todas las muestras en el estudio AAV u OIR se eliminaron de nuestro análisis. Normalizamos los valores de expresión de conteo usando la función voom proporcionada por limma (versión 3.44.3). En el estudio de AAV, corregimos un efecto de lote identificado asociado con el lote de extracción de ARN (variable: rna_extraction_batch) mediante la función ComBat (paquete sva versión 3.40.0). El análisis de componentes principales se realizó utilizando el paquete pcaMethods R (versión 1.80.0) seleccionando los 1000 genes más variables.

La expresión génica diferencial se calculó utilizando la función lmFit proporcionada por el paquete limma R. Los genes que cambiaron significativamente se seleccionaron en función de un valor de p ajustado por BH < 0,05. La información de la ruta se recuperó mediante el paquete misgdbr R (versión 7.1.1). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó utilizando la función de análisis de representación excesiva (ORA) proporcionada por Clusterprofiler versión 4.0.2. Las comparaciones directas entre conjuntos de genes derivados del experimento AAV y el estudio OIR se llevaron a cabo utilizando una prueba hipergeométrica proporcionada por el paquete stats R (versión 4.1.0). Los diagramas de Venn se trazaron usando ggvenn (versión 0.1.9).

Los conjuntos de datos de RNA-Seq de una sola célula se obtuvieron de GSE1352229, GSE130636 y GSE135922. Si era necesario, los ID de ensembl humanos se asignaban a homólogos de ratón utilizando el paquete biomaRt R (2.48.2), con el parámetro de host establecido en http://feb2021.archive.ensembl.org/. Los recuentos sin procesar se procesaron adicionalmente utilizando el paquete Seurat R (versión 4.0.3). Se identificaron genes específicos de células para cada conjunto de datos individual y tipo de célula a través de la función FindMarkers. Los genes se definieron como específicos de células si el valor de p ajustado por BH era < 0,01 y el gen no se identificaba como específico de ningún otro tipo de célula (solo genes únicos). Como antes, la superposición entre los genes marcadores específicos de células y los conjuntos de genes derivados de los estudios AAV u OIR se cuantificó mediante la función ORA de clusterProfiler.

Todos los datos se han depositado en la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) y están disponibles bajo GSE200191 y GSE200195. El código utilizado para este estudio está disponible en https://github.com/bi-compbio/AAV_retinopathy_models.

Kliffen, M., Sharma, HS, Mooy, CM, Kerkvliet, S. & de Jong, PTVM Aumento de la expresión de factores de crecimiento angiogénicos en la maculopatía relacionada con la edad. Hermano J. Oftalmol. 81, 154 (1997).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aiello, LP et al. Factor de crecimiento del endotelio vascular en el líquido ocular de pacientes con retinopatía diabética y otros trastornos de la retina. N. ingl. J.Med. 331, 1480–1487 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Funatsu, H. et al. Los niveles vítreos de interleucina-6 y factor de crecimiento endotelial vascular están relacionados con el edema macular diabético. Oftalmología 110, 1690–1696 (2003).

Artículo PubMed Google Académico

Piedra, J. et al. Papeles del factor de crecimiento endotelial vascular y la degeneración de astrocitos en la génesis de la retinopatía del prematuro. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 37, 290–299 (1996).

CAS Google Académico

Lim, LS, Mitchell, P, Seddon, JM, Holz, FG y Wong, TY Degeneración macular relacionada con la edad. Lanceta 379, 1728-1738 (2012).

Artículo PubMed Google Académico

Nicholson, BP & Schachat, AP Una revisión de ensayos clínicos de agentes anti-VEGF para la retinopatía diabética. Archivo de Graefe Clin. Exp. Oftalmol. 248, 915–930 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Demircan, N., Safran, BG, Soylu, M., Ozcan, AA y Sizmaz, S. Determinación de los niveles de interleucina-1 (IL-1) vítrea y factor de necrosis tumoral (TNF) en la retinopatía diabética proliferativa. Ojo 20, 1366–1369 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Funatsu, H. et al. Los niveles de citocinas en el humor acuoso están relacionados con los niveles vítreos y la progresión de la retinopatía diabética en pacientes diabéticos. Archivo de Graefe Clin. Exp. Oftalmol. 243, 3–8 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Lacombe, MS et al. Humor acuoso y suero factor de necrosis tumoral-α en la uveítis clínica. Res oftálmica. 33, 251–255 (2001).

Artículo Google Académico

de Boer, JH et al. Análisis de los niveles de IL-6 en líquido vítreo humano obtenido de pacientes con uveítis, pacientes con trastornos intraoculares proliferativos y ojos de banco de ojos. actual ojo Res. 11, 181–186 (2009).

Artículo Google Académico

Smith, LE et al. Retinopatía inducida por oxígeno en el ratón. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 35, 101–111 (1994).

CAS Google Académico

Scott, A. & Fruttiger, M. Retinopatía inducida por oxígeno: un modelo para la patología vascular en la retina. Ojo 24, 416–421 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lai, C.-M. et al. Generación de ratones transgénicos con neovascularización retiniana leve y severa. Hermano J. Oftalmol. 89, 911 (2005).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Rahman, ISA, Li, C.-R., Lai, C.-M. & Rakoczy, EP Monitoreo in vivo del daño retiniano inducido por VEGF en el modelo de neovascularización retiniana del ratón kimba. actual ojo Res. 36, 654–662 (2011).

Artículo Google Académico

Ohno-Matsui, K. et al. La expresión inducible del factor de crecimiento endotelial vascular en ratones adultos causa retinopatía proliferativa grave y desprendimiento de retina. Soy. J. Pathol. 160, 711–719 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aiello, LP et al. La permeabilidad retiniana inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular está mediada por la proteína quinasa C in vivo y suprimida por un inhibidor selectivo de isoformas eficaz por vía oral. Diabetes 46, 1473–1480 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ozaki, H. et al. La liberación sostenida intravítrea de VEGF provoca neovascularización retiniana en conejos y ruptura de la barrera hematorretiniana en conejos y primates. Exp. ojo Res. 64, 505–517 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tolentino, MJ et al. El factor de crecimiento endotelial vascular es suficiente para producir neovascularización del iris y glaucoma neovascular en un primate no humano. Arco. Oftalmol. 114, 964–970 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Weigelt, CM et al. La expresión mediada por AAV de VEGF, TNF-α e IL-6 humanos induce patología retiniana en ratones. Traducir Vis. ciencia Tecnología 10, 15–15 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wang, F. et al. La expresión del factor de crecimiento endotelial vascular mediada por AAV induce la neovascularización coroidea en ratas. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 44, 781–790 (2003).

Artículo Google Académico

Lebherz, C. et al. Modelos de primates no humanos para la neovascularización ocular diabética utilizando la sobreexpresión del factor de crecimiento endotelial vascular mediada por AAV2. Diabetes 54, 1141–1149 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rakoczy, PE et al. Expresión del factor de crecimiento endotelial vascular mediada por virus recombinante adenoasociado mejorado en la retina de ratón adulto: un modelo potencial para la retinopatía diabética. Diabetes 52, 857–863 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Liu, S. et al. Un nuevo modelo de rata de neovascularización coroidea quiescente sin tratamiento previo inducida por la sobreexpresión de VEGF165 humano. Biol. Abra https://doi.org/10.1242/bio.048736 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sone, H. et al. Efectos de la administración intraocular o sistémica de anticuerpos neutralizantes contra el factor de crecimiento del endotelio vascular en el modelo experimental murino de retinopatía. Ciencias de la vida 65, 2573–2580 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rosenbaum, JT, McDevitt, HO, Guss, RB & Egbert, PR Uveítis inducida por endotoxinas en ratas como modelo de enfermedad humana. Naturaleza 286, 611–613 (1980).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Agarwal, RK, Silver, PB & Caspi, RR Métodos y protocolos de autoinmunidad. Métodos Mol. Biol. 900, 443–469 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Caspi, RR et al. Un nuevo modelo de enfermedad autoinmune. Uveoretinitis autoinmune experimental inducida en ratones con dos antígenos retinales diferentes. J. Immunol. Baltim. MD 140, 1490–1495 (1988).

CAS Google Académico

Jiang, W., Anderson, MS, Bronson, R., Mathis, D. y Benoist, C. Modifier loci condition autoimmunity provocada por la deficiencia de Aire. Exp. J. Medicina. 202, 805–815 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeVoss, J. et al. Autoinmunidad espontánea prevenida por la expresión tímica de un solo autoantígeno. Exp. J. Medicina. 203, 2727–2735 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cunha, APD et al. La jerarquía de las citocinas proinflamatorias en la inflamación ocular. actual ojo Res. 43, 1–13 (2017).

Google Académico

Hoekzema, R., Murray, PI, van Haren, MA, Helle, M. y Kijlstra, A. Análisis de la interleucina-6 en la uveítis inducida por endotoxinas. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 32, 88–95 (1991).

CAS Google Académico

Nakazawa, T. et al. El factor de necrosis tumoral-α media la muerte de oligodendrocitos y la pérdida retardada de células ganglionares de la retina en un modelo de ratón con glaucoma. J. Neurosci. 26, 12633–12641 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sartani, G. et al. La terapia con factor de necrosis antitumoral alfa suprime la inducción de uveoretinitis autoinmune experimental en ratones mediante la inhibición de la preparación antigénica. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 37, 2211–2218 (1996).

CAS Google Académico

Hohki, S. et al. El bloqueo de la señalización de la interleucina-6 suprime la uveoretinitis autoinmune experimental mediante la inhibición de las respuestas inflamatorias Th17. Exp. ojo Res. 91, 162–170 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Dick, AD, Duncan, L., Hale, G., Waldmann, H. & Isaacs, J. La actividad neutralizante del TNF-alfa modula el fenotipo y la función de las células T en la uveoretinitis autoinmune experimental. J. Autoinmune. 11, 255–264 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Becker, K. et al. El análisis transcriptómico en profundidad de la retina humana revela los mecanismos moleculares subyacentes a la retinopatía diabética. ciencia Rep. 11, 10494 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, EJ et al. El perfil completo del transcriptoma de los tejidos oculares con degeneración macular normal y relacionada con la edad revela una desregulación de la transcripción antisentido. ciencia Rep. 8, 3040 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ratnapriya, R. et al. El transcriptoma retinal y los análisis de eQTL identifican genes asociados con la degeneración macular relacionada con la edad. Nat. Gineta. 51, 606–610 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qiu, Y. et al. Análisis del transcriptoma retiniano de todo el genoma de la uveítis inducida por endotoxinas en ratones con secuenciación de próxima generación. mol. Vis. 23, 395–406 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Chen, L. et al. Cambios inducidos por daños por luz en la expresión génica de la retina de ratón. Exp. ojo Res. 79, 239–247 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Uren, PJ, Lee, JT, Doroudchi, MM, Smith, AD y Horsager, A. Un perfil de cambios transcriptómicos en el modelo de ratón rd10 de retinosis pigmentaria. mol. Vis. 20, 1612–1628 (2014).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Xing, X. et al. Identificación de nuevos genes expresados ​​diferencialmente en retinas de ratas diabéticas a largo plazo inducidas por STZ mediante secuenciación de ARN. mol. Gineta. genoma Medicina. 8, e1115 (2020).

CAS Google Académico

Guarischi-Sousa, R. et al. Una firma basada en transcriptomas de angiogénesis patológica predice la supervivencia de pacientes con cáncer de mama. Plós Genet. 15, e1008482 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wang, Y. et al. MiARN expresados ​​diferencialmente en modelos de ratones recién nacidos con retinopatía inducida por oxígeno. mol. Medicina. Rep. 15, 146–152 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhou, H. et al. Perfiles de circRNA inducidos por oxígeno y redes corregulatorias en un modelo de ratón de retinopatía del prematuro. Exp. El r. Medicina. 18, 2037-2050 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Yang, X., Dong, X., Jia, C. y Wang, Y. Perfiles de genes asociados con el modelo murino de retinopatía inducida por oxígeno. mol. Vis. 19, 775–788 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Desjarlais, M. et al. Perfil de expresión de microARN en retina y coroides en modelo de retinopatía inducida por oxígeno. PLoS ONE 14, e0218282 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heng, JS et al. Análisis exhaustivo de un modelo de ratón de uveoretinitis espontánea mediante secuenciación de ARN unicelular. proc. Nat. Academia ciencia 116, 26734–26744 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed Central Google Scholar

Voigt, AP et al. Transcripción unicelular del epitelio pigmentario de la retina humana y la coroides en la salud y la degeneración macular. proc. Nat. Academia ciencia 116, 24100–24107 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sol, L. et al. Secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-Seq) que descifra alteraciones patológicas en retinas diabéticas inducidas por estreptozotocina. Exp. ojo Res. 210, 108718 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hove, IV et al. El análisis del transcriptoma de una sola célula de la retina del ratón Akimba revela conocimientos específicos del tipo de célula sobre la patobiología de la retinopatía diabética. Diabetología 63, 2235–2248 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Lu, Y. et al. El análisis de una sola célula de la retina humana identifica mecanismos conservados evolutivamente y específicos de la especie que controlan el desarrollo. desarrollo Celda 53, 473-491.e9 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lukowski, SW et al. Un atlas de transcriptoma unicelular de la retina humana adulta. EMBO J. 38, e100811 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Voigt, AP et al. Caracterización molecular de la retina humana foveal versus periférica mediante secuenciación de ARN unicelular. Exp. ojo Res. 184, 234–242 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klimczak, RR, Koerber, JT, Dalkara, D., Flannery, JG & Schaffer, DV Una nueva variante viral adenoasociada para la transducción intravítrea eficiente y selectiva de células de müller de rata. PLoS ONE 4, e7467 (2009).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bradley, J. Enfermedad inflamatoria mediada por TNF. J. Pathol. 214, 149–160 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Weigelt, CM et al. Caracterización y validación de modelos in vitro e in vivo para investigar la inflamación inducida por TNF-α en enfermedades de la retina. Traducir Vis. ciencia Tecnología 11, 18 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sennlaub, F., Courtois, Y. & Goureau, O. La sintasa de óxido nítrico inducible media la apoptosis retiniana en la retinopatía proliferativa isquémica. J. Neurosci. 22, 3987–3993 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dejda, A. et al. La neuropilina-1 media la quimioatracción de células mieloides e influye en la diafonía neuroinmune retiniana. J. Clin. investigando 124, 4807–4822 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wu, J. et al. Terapia génica para el glaucoma por alteración de la acuaporina 1 del cuerpo ciliar utilizando CRISPR-Cas9. mol. El r. 28, 820–829 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yates, JRW et al. Complemento variante C3 y el riesgo de degeneración macular relacionada con la edad. N. ingl. J.Med. 357, 553–561 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fritsche, LG et al. Un gran estudio de asociación de todo el genoma de la degeneración macular relacionada con la edad destaca las contribuciones de variantes raras y comunes. Nat. Gineta. 48, 134–143 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Haines, JL et al. La variante del factor H del complemento aumenta el riesgo de degeneración macular relacionada con la edad. Ciencia 308, 419–421 (2005).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Yang, M. et al. Asociación de polimorfismos C2 y CFB con uveítis anterior. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 53, 4969 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Natoli, R. et al. Los macrófagos retinianos sintetizan C3 y activan el complemento en la DMAE y en modelos de degeneración retiniana focal macrófagos retinianos que expresan el complemento en la DMAE. Invertir. Oftalmología Vis. ciencia 58, 2977–2990 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Anderson, DH et al. El papel fundamental del sistema del complemento en el envejecimiento y la degeneración macular relacionada con la edad: Hipótesis revisada. prog. Retin. ojo Res. 29, 95–112 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mondino, BJ, Glovsky, MM & Ghekiere, L. Complemento activado en humor acuoso inflamado. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 25, 871–873 (1984).

CAS Google Académico

Bansal, R. et al. Perfil proteómico del vítreo en pacientes con uveítis tuberculosa. Tuberculosis 126, 102036 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Vergani, S. et al. Activación del complemento en la uveítis. Hermano. J. Oftalmol. 70, 60 (1986).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Akhtar-Schäfer, I., Wang, L., Krohne, TU, Xu, H. & Langmann, T. Modulación de tres vías inmunes innatas clave para las enfermedades degenerativas de la retina más comunes. EMBOmol. Medicina. https://doi.org/10.15252/emmm.201708259 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Liao, DS et al. Complemento del inhibidor de C3 pegcetacoplan para la atrofia geográfica secundaria a la degeneración macular relacionada con la edad. Oftalmología 127, 186–195 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Jaffe, GJ et al. Inhibidor de C5 avacincaptad Pegol para la atrofia geográfica debido a la degeneración macular relacionada con la edad: un ensayo aleatorizado fundamental de fase 2/3. Oftalmología https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2020.08.027 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Cashman, SM, Desai, A., Ramo, K. y Kumar-Singh, R. La expresión del componente del complemento 3 (C3) de un adenovirus conduce a patología en la retina murina. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 52, 3436–3445 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Landowski, M. et al. El polimorfismo Y402H del factor H del complemento humano provoca un fenotipo de degeneración macular relacionada con la edad y una desregulación de las lipoproteínas en ratones. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 116, 3703–3711 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Canción, D. et al. La mutación W1206R del factor H del complemento causa trombosis retiniana y retinopatía isquémica en ratones. Soy. J. Pathol. 189, 826–838 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ufret-Vincenty, RL et al. Los ratones transgénicos que expresan variantes del factor H del complemento desarrollan hallazgos retinianos similares a los de la AMD. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 51, 5878–5887 (2010).

Artículo Google Académico

Williams, JAE et al. Regulación de la activación de C3 por la vía alternativa del complemento en la retina del ratón. PLoS ONE 11, e0161898 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhang, L., Bell, BA, Li, Y., Caspi, RR y Lin, F. El componente C4 del complemento regula el desarrollo de uveítis autoinmune experimental a través de un mecanismo intrínseco de células T. Frente. inmunol. 8, 1116 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Kumar, B., Cashman, SM y Kumar-Singh, R. Activación mediada por complemento del inflamasoma NLRP3 y su inhibición por la entrega de CD59 mediada por AAV en un modelo de uveítis. mol. El r. 26, 1568-1580 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bora, NS et al. La activación del complemento a través de una vía alternativa es fundamental en el desarrollo de la neovascularización coroidea inducida por láser: papel del factor B y el factor HJ Immunol. 177, 1872–1878 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kim, SJ et al. Factor H del complemento humano intravítreo en un modelo de rata de neovascularización coroidea inducida por láser. Hermano J. Oftalmol. 97, 367 (2013).

Artículo PubMed Google Académico

Brockmann, C. et al. La inhibición intravítrea del complemento C5a reduce la neovascularización coroidea en ratones. Archivo de Graefe Clin. Exp. Oftalmol. 253, 1695–1704 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Peng, K. et al. MAdCAM-1 media la degeneración de las neuronas retinianas en la colitis experimental mediante el reclutamiento de células T CD4+ que se alojan en el intestino. inmunol. de mucosas. 14, 152–163 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Grant, AJ, Lalor, PF, Hübscher, SG, Briskin, M. & Adams, DH MAdCAM-1 expresado en la enfermedad hepática inflamatoria crónica apoya la adhesión de los linfocitos de la mucosa al endotelio hepático (MAdCAM-1 en la enfermedad hepática inflamatoria crónica). Hepatología 33, 1065–1072 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Oshima, T. et al. Regulación y distribución de MAdCAM-1 en células endoteliales in vitro. Soy. J. Physiol.-Cell Physiol. 281, C1096–C1105 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Catalán-Serra, I. & Brenna, Ø. Inmunoterapia en la enfermedad inflamatoria intestinal: tratamientos novedosos y emergentes. Tararear. Vac. Inmunotro. https://doi.org/10.1080/21645515.2018.1461297 (2018).

Artículo Google Académico

Hysa, E. et al. Inmunopatofisiología e impacto clínico de la uveítis en las enfermedades reumáticas inflamatorias: una actualización. EUR. J. Clin. investigando 51, e13572 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Sugita, S. et al. Inhibición de la inflamación mediada por células T en la uveítis por un nuevo anticuerpo anti-CD3. Artritis Res. El r. 19, 176 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zasada, M. et al. Impacto a corto y largo plazo de la hiperoxia en el transcriptoma de las células sanguíneas y retinales en un modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno. pediatra Res. 87, 485–493 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rocha, SF et al. Esm1 modula el comportamiento de las células de la punta endotelial y la permeabilidad vascular al mejorar la biodisponibilidad de VEGF. Circ. Res. 115, 581–590 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Su, T. et al. El bloqueo de Endocan suprime la neovascularización ocular experimental en ratones. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 59, 930 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Vähätupa, M., Järvinen, TAH & Uusitalo-Järvinen, H. Exploración del modelo de retinopatía inducida por oxígeno para descubrir nuevos objetivos farmacológicos terapéuticos en las retinopatías. Frente. Farmacol. 11, 873 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Stahl, A. et al. La retina de ratón como modelo de angiogénesis. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 51, 2813–2826 (2010).

Artículo Google Académico

Diao, L., Sun, W., Deng, Q. & He, S. Desarrollo de la retina del ratón: Diversidad morfológica emergente de las células ganglionares. J. Neurobiol. 61, 236–249 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Selvam, S., Kumar, T. & Fruttiger, M. Desarrollo vascular de la retina en salud y enfermedad. prog. Retin. ojo Res. 63, 1–19 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Vessey, KA, Wilkinson-Berka, JL y Fletcher, EL Caracterización de la función retiniana y la respuesta de las células gliales en un modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno. J.Comp. Neurol. 519, 506–527 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fletcher, EL et al. La importancia de los cambios en las células neuronales y gliales en la retina de rata durante la retinopatía inducida por oxígeno. Doc. Oftalmol. 120, 67–86 (2010).

Artículo PubMed Google Académico

Descargar referencias

Estamos muy agradecidos a Manuel Deubler, Jürgen Haller, Jan Hering, Oliver Da Cruz Rodrigues Radmacher por su excelente asistencia técnica con respecto a todos los experimentos in vivo de AAV y a Heike Bühler, Sabine Baierl y Martin Steiner por el experimento OIR. La generación de AAV fue respaldada por Benjamin Strobel y el laboratorio de AAV en Boehringer Ingelheim. Agradecemos a Daniel Gerlach por su ayuda en la creación de archivos de genoma personalizados para el estudio AAV y a Tanja Schönberger por apoyar el análisis histológico. Agradecemos a Elke Markert y Thomas Ciossek por sus fructíferos debates científicos. La figura 1a se generó con BioRender.com.

Estos autores contribuyeron por igual: Kolja Becker y Carina M. Weigelt.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Holger Klein y Norbert H. Redemann.

Biología computacional global y ciencias digitales, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riss, Alemania

Kolja Becker, Coralie Viollet, Werner Rust, Francesc Fernández-Albert, Eric Simon y Holger Klein

Investigación de enfermedades cardiometabólicas, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riss, Alemania

Carina M. Weigelt, Holger Fuchs, Nina Zippel, Remko A. Bakker y Norbert H. Redemann

Ciencias del descubrimiento de fármacos, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riss, Alemania

Hannah Wyatt y Thorsten Lamla

Desarrollo clínico y operaciones corporativas, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riß, Alemania

jochen huber

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

KB y CMW diseñaron los experimentos, interpretaron los resultados, escribieron el manuscrito y prepararon las figuras. KB realizó el análisis bioinformático y CMW realizó los experimentos in vivo e in vitro. CV y WR diseñaron y realizaron la secuenciación de ARN y HW apoyó el análisis histológico y TL la producción de AAV. HF y JH supervisó los experimentos in vivo y NZ apoyó los experimentos in vitro. FF, RAB, HK y NHR supervisó el proyecto y revisó el manuscrito. Todos los autores leyeron el manuscrito y contribuyeron a la revisión.

Correspondencia a Kolja Becker.

Todos los autores son empleados de Boehringer Ingelheim y el estudio ha sido financiado en su totalidad por Boehringer Ingelheim.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Becker, K., Weigelt, CM, Fuchs, H. et al. Análisis transcriptómico de modelos de retinopatía inducida por AAV que expresan VEGF, TNF-α e IL-6 humanos en ojos murinos. Informe científico 12, 19395 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23065-4

Descargar cita

Recibido: 20 Abril 2022

Aceptado: 25 de octubre de 2022

Publicado: 12 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23065-4

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.