Los invadopodios permiten la invasión cooperativa y la metástasis de las células de cáncer de mama

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 758 (2022) Citar este artículo

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Las células cancerosas invasivas y no invasivas pueden invadir juntas durante la invasión cooperativa. Sin embargo, se desconocen los eventos que conducen a ella, el papel de la transición epitelio-mesenquimatosa y las consecuencias que esto puede tener sobre la metástasis. En este estudio, demostramos que las células isogénicas de cáncer de mama 4T1 y 67NR se clasifican entre sí en esferoides 3D, seguido de una invasión cooperativa. Mediante microscopía de lapso de tiempo, mostramos que las células 4T1 invasivas se mueven de manera más persistente en comparación con las 67NR no invasivas, clasificándose y acumulándose en la interfaz de matriz esferoide, un proceso que depende de las adherencias de matriz celular e independiente de E-cadherina célula-célula adherencias. La eliminación de invadopodios en células 4T1 bloquea la invasión, lo que demuestra que el requisito de invadopodios se limita a las células líder. Es importante destacar que demostramos que las células con y sin invadopodios también pueden participar en metástasis cooperativa en modelos preclínicos de ratones. En conjunto, nuestros resultados sugieren que un pequeño número de células con invadopodios puede impulsar la metástasis de grupos de células heterogéneas.

Más del 90% de los pacientes con cáncer mueren debido a complicaciones derivadas de la metástasis, es decir, el proceso de diseminación, resiembra y crecimiento de células cancerosas en órganos secundarios1,2. En el cáncer de mama, trabajos recientes demostraron que las metástasis surgen principalmente de siembras policlonales3,4. Estas metástasis policlonales se desarrollan a partir de la diseminación colectiva de grupos de células, a diferencia de la acumulación sucesiva de múltiples clones individuales. Junto con la creciente literatura sobre la heterogeneidad fenotípica dentro de los tumores primarios5, estas observaciones sugieren que la cooperación entre clones de células cancerosas puede facilitar la metástasis.

En el cáncer de mama, la cascada metastásica se inicia cuando las células cancerosas adquieren propiedades invasivas, que incluyen la integración de la motilidad y la capacidad de degradar la matriz extracelular (MEC)2. Tanto la invasión como la motilidad se asocian comúnmente con la activación del programa de transición epitelial-mesenquimatosa (EMT)6. Durante la EMT, las células epiteliales pierden gradualmente los contactos célula-célula, fortalecen progresivamente sus adherencias a la ECM y aumentan su contractilidad, volviéndose móviles. Concomitantemente a la EMT, las células cancerosas también pueden adquirir la capacidad de degradar localmente la MEC utilizando invadopodios7,8,9,10. Los invadopodios son protuberancias de membrana enriquecidas en metaloproteinasas de matriz (MMP) que confieren a las células cancerosas una alta actividad proteolítica11,12 y, lo que es más importante, un elevado potencial metastásico13,14. Dado que el programa EMT no es un interruptor binario ni unidireccional, y dado que existen múltiples rutas EMT, distintas trayectorias EMT pueden dar como resultado clones de cáncer con diferentes niveles de invasividad15.

El trabajo in vitro 3D reciente sobre el cáncer de mama mostró que las hebras colectivas invasivas están compuestas de células cancerosas que difieren en múltiples rasgos invasivos3,16,17,18,19,20. Por ejemplo, en comparación con las células seguidoras, las células líder muestran una mayor contractilidad19, adhesión célula-MEC3,16, remodelación de la MEC20 y capacidades de degradación de la MEC18,19. Como resultado, las células líder pueden permitir la invasión de células seguidoras que de otro modo no serían invasivas, un fenómeno denominado invasión cooperativa21. Nuestro trabajo reciente mostró que las células líder residen en gran medida en la fase G1 del ciclo celular, la fase del ciclo celular durante la cual la degradación de ECM mediada por invadopodios es la más alta22. Estos datos sugieren que durante la invasión colectiva, las células líder pueden ensamblar preferentemente invadopodios. Aunque la ruptura de la ECM es claramente necesaria para la invasión colectiva, el papel de la degradación de la ECM mediada por invadopodios en las células líder frente a las células seguidoras no está claro. A la fecha, ninguno de los estudios detalla la reorganización espacial que puede preceder a la invasión cooperativa. Además, como todos los estudios anteriores investigaron la invasión cooperativa en cultivos 3D, aún no se exploró la cooperación durante la diseminación y la metástasis.

En este estudio, nuestro objetivo es comprender cómo los clones de cáncer con habilidades invasivas diferenciales pueden cooperar durante la invasión y la metástasis. Mostramos que los clones invasivos pueden separarse y conducir a los clones no invasivos a una invasión y metástasis cooperativas. Nuestro estudio sugiere que la cooperatividad entre las células cancerosas puede ser un mecanismo eficaz para la metástasis colectiva.

Para investigar cómo cooperan los clones de cáncer con habilidades invasivas diferenciales durante la metástasis, utilizamos el par isogénico de líneas celulares de cáncer de mama 4T1 y 67NR, singénicas con ratones Balb/C23,24. Tras la implantación ortotópica, ambas líneas celulares desarrollan tumores primarios, pero solo las células 4T1 metastatizan25. Evaluamos las capacidades invasivas de las células 4T1 y 67NR en el ensayo de invasión de esferoides en el colágeno I de alta densidad, que requiere la degradación de la matriz impulsada por MMP22. Después de dos días, encontramos que las células 4T1 exhibieron una fuerte invasión en la matriz de colágeno I, mientras que las células 67NR no invadieron (Fig. 1a, b). El tratamiento con el inhibidor pan-MMP GM6001 bloqueó efectivamente la invasión de células 4T1 (Fig. 1a, b). Además, el marcado por inmunofluorescencia de los sitios de escisión de colágeno I mediados por MMP (Col ¾) mostró que la invasión de células 4T1 en la matriz dependía de MMP (Fig. 1c). El tratamiento con mitomicina C, que altera la división celular26, confirmó que la invasión de células 4T1 no se debía a proliferación celular (figs. 1a, b y S1). Se sabe que las células 4T1 invaden como hebras colectivas, con presencia de E-cadherina en las uniones célula-célula27,28. Confirmamos que las células 4T1 expresaron E-cadherina, mientras que las células 67NR expresaron N-cadherina (Fig. S2a, b) 27,28,29. Tanto las líneas celulares 4T1 como las 67NR expresaron vimentina (Fig. S2a). Curiosamente, en el eje EMT (continuo fenotípico de epitelial a mesenquimatoso), esto clasifica las células 4T1 invasivas como epiteliales/mesenquimales y las células 67NR no invasivas como mesenquimales. Además, en los esferoides 4T1, encontramos que la E-cadherina estaba enriquecida en todas las uniones célula-célula, es decir, entre las células líder y seguidora, así como entre las células seguidoras y seguidoras. Esto verificó que la integridad de las uniones célula-célula mediadas por E-cadherina se mantuvo durante la invasión (Fig. S2c, d)30. En general, estos resultados demostraron que las células 4T1 realizan una invasión colectiva dependiente de MMP, mientras que las células 67NR no invaden la matriz densa de colágeno I.

a Esferoides de células 4T1 y 67NR en el día 0 y el día 2 después de la inclusión en una matriz de colágeno I 3D. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Los esferoides se trataron desde el día 0 con un inhibidor pan-MMP (GM6001, panel superior derecho), un inhibidor del ciclo celular (mitomicina C, Mito C, panel inferior derecho) o control DMSO (paneles izquierdos). Barras de escala: 100 µm. b Área del esferoide en función del tiempo para las células 4T1 y 67NR de (a). P = 5,81 × 10−4 y 1,23 × 10−4, por la prueba t. c Hebra invasora de un esferoide 4T1, día 2 después de la incrustación, inmunomarcada para colágeno I dividido por MMP (Col-3/4, verde) y teñida para F-actina (faloidina, magenta) y núcleos (DAPI, azul). Barra de escala: 50 µm. d Western blot de expresión de Tks5 y cortactina en células 4T1 y 67NR. La β-actina se usa como control de carga. e Degradación de gelatina para células 4T1 (panel superior) y 67NR (panel inferior) 18 h después de la siembra. Los recuadros muestran un zoom de 4X del área encuadrada y las puntas de flecha indican orificios de degradación representativos. Barras de escala: 20 µm. Ver Fig. S3a para F-actina. f Área de degradación para celdas 4T1 y 67NR de (e). P < 4,40 × 10−16, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. g Células 4T1 cultivadas en gelatina fluorescente (gris), marcadas para Tks5 (verde) y F-actina (faloidina, magenta). Los recuadros muestran un zoom 2X del área encuadrada y las puntas de flecha indican invadopodios funcionales representativos. Barra de escala: 10 µm. hebra h 4T1 el día 2 días después de la incrustación, etiquetada para Tks5 (verde), colágeno dividido (cian), actina F (magenta) y núcleos (azul). Los recuadros muestran un zoom de 1,25X del área encuadrada. Barra de escala: 30 µm. Monocapas i 4T1 (izquierda) y 67NR (derecha) 24 h después de la herida. Se muestran trayectorias celulares representativas. Ver Película S1. Barras de escala: 100 µm. j Trayectorias de las células 4T1 (arriba) y 67NR (abajo) del ensayo de heridas en (i), que se muestran como gráficas de rosa de los vientos desplazadas hacia un origen común. k Velocidad instantánea de las celdas 4T1 y 67NR de (j). P = 1,17 × 10−13, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. l Persistencia (desplazamiento neto/longitud de trayectoria) de las celdas 4T1 y 67NR de (j). P < 2,20 × 10−16, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Las transferencias occidentales sin recortar están disponibles en la figura complementaria S13.

Los invadopodios son protuberancias de membrana enriquecidas en actina, proteínas de unión a actina, como cortactin y Tks5, y MMP11,12. Como la función de los invadopodios da como resultado la degradación local de la MEC, planteamos la hipótesis de que los invadopodios desempeñan un papel en la invasión de las células 4T1. También razonamos que la diferencia observada en las capacidades de invasión de las células 4T1 frente a las 67NR podría explicarse, al menos en parte, por una disparidad en su función invadopodia. Para probar esto, primero analizamos el nivel de expresión de los componentes clave de invadopodios cortactin y Tks511. Ambas líneas celulares expresaron niveles similares de cortactin y Tks5 (Fig. 1d). A continuación, medimos la función de los invadopodios cultivando células sobre gelatina marcada con fluorescencia, lo que permite visualizar la degradación como agujeros en la matriz31. Descubrimos que las células 4T1, pero no las células 67NR, pudieron degradar la capa de gelatina (Fig. 1e, f). Los puntos de Tks5 co-localizados, F-actina y gelatina degradada, indicativos de invadopodios maduros y funcionales, estaban presentes en las células 4T1 (Fig. 1g). Esto sugiere que los agujeros de degradación observados fueron generados por invadopodios. Los puntos de Tks5 co-localizados y F-actina, indicativos de precursores de invadopodios, estaban presentes en las células 4T1 y 67NR, en niveles similares (Fig. S3a, b). En conjunto, estos resultados sugieren que el precursor de invadopodios no madura en las células 67NR. Para examinar si los invadopodios también desempeñan un papel en la invasión de las células 4T1 en los esferoides, etiquetamos los esferoides para los sitios de escisión de colágeno I mediada por F-actina, Tks5 y MMP. Identificamos invadopodios funcionales en células líder, demostrado por la co-localización de sitios de escisión de colágeno I mediados por F-actina, Tks5 y MMP (Fig. 1h). Estas observaciones establecieron un vínculo entre los invadopodios y la invasión colectiva de células 4T1 y sugieren que las células líder ensamblan invadopodios.

Dado que el fenotipo de invasión consiste en la degradación de ECM mediada por invadopodios y la migración celular32, realizamos un ensayo de rascado para investigar si las células 67NR pueden migrar tan eficientemente como las células 4T1. Hicimos un seguimiento de las células individuales (Fig. 1i, j y Película S1) y descubrimos que, si bien la velocidad instantánea de las células 67NR es más alta que la de las células 4T1 (Fig. 1k), las células 4T1 son significativamente más persistentes que las células 67NR (Fig. 1l ).

En resumen, mostramos que el par 4T1/67NR es una herramienta adecuada para investigar cómo cooperan los clones de cáncer con capacidades invasivas diferenciales durante la invasión.

A continuación, nos propusimos investigar la dinámica de la organización espacial y la invasión en los esferoides donde se mezclan 4T1 y 67NR. Generamos líneas celulares 4T1-mScarlet y 67NR-GFP y las mezclamos en una proporción de 1:50, para dar cuenta de la mayor tasa de proliferación de 4T1 en el transcurso del ensayo de invasión de esferoides (Fig. S4a, b). A continuación, incrustamos los esferoides mixtos en colágeno I y realizamos imágenes longitudinales diarias (Figs. 2a y S4c)33. Notamos que las células 67NR y 4T1 se clasificaron entre sí a partir del día 3. Los cortes ópticos individuales (Película S2) y el análisis de las coordenadas celulares demostraron claramente el enriquecimiento de las células 4T1 en el borde de los esferoides (Figs. 2b y S4d). Para cuantificar la clasificación de celdas, calculamos la distancia relativa de cada celda al centro del esferoide, una métrica que llamamos Índice de distancia (DI), de modo que un valor de 0 marca una celda en el centro del esferoide y un valor de 1 corresponde a una celda en la interfaz esferoide-colágeno I (Fig. 2c). En el día 3 posterior a la incorporación, encontramos que la DI de las células 4T1 aumentó con el tiempo y fue significativamente más alta que la DI de las células 67NR (Fig. 2d). Esta tendencia también estuvo presente en esferoides individuales (Fig. S4e). Estos datos revelaron que, en el transcurso de 3 días, las células se reorganizaron de una distribución aleatoria a esferoides con células 4T1 en la interfaz y células 67NR ubicadas en el núcleo del esferoide. En los días 4-6, la clasificación celular de las células 4T1 y 67NR fue seguida por la invasión (Fig. S4f).

un esferoide mixto, en una proporción de 1:50 de células 4T1-mScarlet (magenta) a 67NR-GFP (verde), incrustado en colágeno I 3D y fotografiado diariamente. El día 1 indica el día 1 posterior a la incorporación. Ver Película S2. Barra de escala: 100 µm. b Coordenadas de las celdas 4T1-mScarlet (4T1-mScar, magenta) y 67NR-GFP (verde) de todos los esferoides presentados en (a) y la Fig. S3c. c Representación esquemática del índice de distancia (DI); a y b representan los semiejes mayor/menor del esferoide y d representa la distancia entre el centro del esferoide y una celda. DI es d/a, la distancia relativa de cada celda al centro del esferoide, véase Materiales y Métodos. d DI para células 4T1-mScarlet (magenta) y 67NR-GFP (cajas verdes) de esferoides en (a, b). P = 1,32 × 10−14 y <2,20 × 10−16, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. e Esferoides mixtos en el día 3 y 4 después de la incrustación. Los esferoides se trataron desde el día 0 con un inhibidor de la contractilidad celular (inhibidor de ROCK, Y-27632, paneles superiores) o un inhibidor pan-MMP (GM6001, paneles inferiores). Barra de escala: 100 µm. f DI para células 4T1-mScarlet (magenta) y 67NR-GFP (verde) de esferoides en (e). g Esquema de los compartimentos del borde (gris oscuro) y del núcleo (gris claro) en un esferoide. h Instantáneas de un esferoide mixto tomadas al principio (día 0,5, 10 h después de la incrustación) y al final de la grabación de lapso de tiempo (día 2,5, 54 h después de la incrustación). Para las células 4T1-mScarlet y 67NR-GFP, se muestran trayectorias de células representativas en los compartimentos del borde y del núcleo, codificadas por colores según el tiempo (paneles de la derecha). Barras de escala: 100 µm. i Δ Índice de distancia (ΔDI) para células 4T1-mScarlet (magenta) y 67NR-GFP (verde) de esferoides en (h). Consulte también Películas S3–6. Un ΔDI positivo indica motilidad celular hacia el borde del esferoide ("Afuera"), y un ΔDI negativo indica movimiento hacia el centro del esferoide ("Adentro"). Los esferoides se trataron desde el día 0 con control DMSO (izquierda) o GM6001 (derecha). P = 0,0204, mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. j Desplazamientos cuadráticos medios (MSD) para celdas 4T1-mScarlet (magenta) y 67NR-GFP (verde) de esferoides en (h). Los MSD se calcularon en las direcciones radial (izquierda) y angular (derecha) del sistema de coordenadas polares para las células de borde (líneas continuas) y núcleo (líneas discontinuas) en esferoides tratados con DMSO (arriba) y GM6001 (abajo), respectivamente. Los gráficos se muestran en escala logarítmica, destacando la naturaleza superdifusiva (α > 1), difusiva (α = 1) y subdifusiva (α < 1) de la motilidad. Las líneas sólidas sirven como guías para el ojo, indicando las pendientes promedio (valores α) correspondientes a estas diferentes modalidades de motilidad. k Se muestra el exponente de la ley de potencia αr (izquierda) para las celdas 4T1-mScarlet (magenta) y 67NR-GFP (verde) de los compartimentos del borde y del núcleo en un esferoide. Se muestra el coeficiente de difusión efectivo en dirección radial para el control de DMSO (arriba a la derecha) o GM6001 (abajo a la derecha) desde los compartimentos del borde y del núcleo en un esferoide.

Se ha demostrado que los esferoides de las células 4T1 contienen laminina, colágeno I y fibronectina en el espacio extracelular34. La presencia de ECM dentro de un esferoide sugiere que la motilidad de las células 3D y, en consecuencia, la clasificación de las células, pueden requerir MMP. Para probar el vínculo entre la motilidad, las MMP y la clasificación celular, tratamos esferoides con un inhibidor de la contractilidad celular (inhibidor de ROCK, Y-27632) o un inhibidor pan-MMP, GM6001. Descubrimos que ambos tratamientos bloquearon la clasificación de células (Fig. 2e, f). Luego realizamos imágenes de lapso de tiempo de esferoides mixtos. Rastreamos celdas individuales dentro del esferoide (Fig. 2h y Películas S3, 4) y para cada celda, calculamos la diferencia entre los índices de distancia inicial y final (ΔDI = DI para la última posición de una celda dada – DI para la posición inicial de una célula determinada), de modo que un ΔDI positivo indica motilidad celular hacia el borde del esferoide ("fuera" en la Fig. 2g, i), y un ΔDI negativo indica movimiento hacia el centro del esferoide ("adentro" en la Fig. 2g, i) ). Un ΔDI nulo indica que no hay movimiento neto. Una vez más, clasificamos cada celda en función de su posición inicial como borde o núcleo, y definimos el compartimento del borde como una capa de dos celdas más cercana a la interfaz esferoide-colágeno (anillo elíptico de 30 µm de ancho; Fig. 2g). Descubrimos que el porcentaje de células rastreadas que cambiaron entre compartimentos durante la duración de la imagen de lapso de tiempo fue insignificante para todas las células, excepto para las células 4T1 ubicadas inicialmente en el núcleo (Fig. S5a). Para las células 4T1, encontramos que el ΔDI fue significativamente mayor para las células cuya posición inicial estaba en el núcleo del esferoide en comparación con las células cuya posición inicial estaba en el borde del esferoide (Fig. 2h, i). Esto indica que las células 4T1 se movieron desde el núcleo del esferoide hacia el borde del esferoide. Por el contrario, las células 4T1 ubicadas en el borde del esferoide tenían un ΔDI cercano a cero, lo que sugiere que las células 4T1 que se encontraron inicialmente en el borde del esferoide se movieron solo dentro de ese compartimento (Fig. 2i). Los ΔDI fueron mínimos para todas las celdas 67NR, independientemente de su posición inicial, lo que indica que estas celdas se movieron solo dentro de los compartimentos en los que se ubicaron inicialmente (Fig. 2i). Dado que ΔDI compara las posiciones inicial y final de las celdas, esta métrica no proporciona información sobre la persistencia de las celdas. De hecho, para un ΔDI dado, la trayectoria de la celda puede ser más o menos tortuosa. Al calcular el desplazamiento cuadrático medio (MSD) de las células en el sistema de coordenadas polares, que captura la simetría del esferoide, determinamos que las células 4T1 son más persistentes en la dirección radial (superdifusivas, α > 1) que las células 67NR (difusivas, α = 1) (Figs. 2j, k y S5b–d). Tanto las células 4T1 como las 67NR tenían un comportamiento de motilidad similar en la dirección angular (Figs. 2j y S5b, c). El tratamiento de esferoides con GM6001 perjudicó el movimiento de las células 4T1 desde el núcleo hasta el borde (Fig. 2i–k, Películas S5, 6) y dio como resultado un coeficiente de difusión efectivo reducido de todas las células en la dirección radial (Figs. 2j, k y S5b–d). Confirmamos que el crecimiento del esferoide fue similar en las condiciones GM6001 y DMSO, lo que sugiere que la pérdida de clasificación celular fue independiente de la proliferación celular (Fig. S5e). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la clasificación celular dentro de los esferoides mixtos está impulsada principalmente por la motilidad dirigida de las células 4T1 desde el núcleo hasta el compartimento del borde y su capacidad para permanecer en el borde, mientras que las células 67NR exhiben motilidad aleatoria (difusiva), permaneciendo en el mismo compartimento a lo largo del tiempo. En resumen, mostramos que las diferencias en la clasificación de células de impulso de persistencia entre las células 4T1 y 67NR.

Si bien la autoorganización y el patrón de las células se estudian intensamente en los tejidos embrionarios y durante el desarrollo, hasta ahora, solo unos pocos estudios probaron mezclas de dos o más tipos de células en el modelo de esferoide de cáncer19,20. La mayoría de los estudios informaron que las células se clasifican en función de la hipótesis de adhesión diferencial, que predice la clasificación en función de las diferencias en la adhesividad intercelular, con las células que exhiben las adhesiones célula-célula más fuertes posicionadas en el centro35. Con base en la expresión de cadherinas para el par 4T1/67NR, la hipótesis de adhesión diferencial predice que en un esferoide 3D, el 4T1 que expresa E-cadherina se separará de las células 67NR que expresan N-cadherina, con las células 4T1 ubicadas en el centro y 67NR células que los rodean. Por el contrario, nuestros datos demuestran el patrón opuesto (Fig. 2a, b), lo que sugiere que la hipótesis de adhesión diferencial puede no aplicarse en nuestro modelo. Para confirmar esto, inhibimos las uniones célula-célula en células 4T1 a través del anticuerpo bloqueador de E-cadherina (Fig. 3a). Curiosamente, el bloqueo de la E-cadherina no eliminó la clasificación celular entre las células 4T1 y 67NR, pero la retrasó 1 día (Fig. 3b). Para confirmar este resultado, generamos líneas celulares estables de eliminación de E-cadherina (Ecad-KD1 y Ecad-KD2; Fig. 3c-e). Según el análisis de transferencia Western, la disminución de la expresión de E-cadherina fue del 36,3 % para Ecad-KD1 y del 96,8 % para Ecad-KD2. Ambas líneas celulares Ecad-KD se separaron de las células 67NR-GFP y se acumularon en el borde del esferoide el día 3 después de la incrustación (Fig. 3g, h). En general, esto sugiere que, en nuestro modelo, la clasificación celular es independiente de la E-cadherina.

a Esferoides mixtos, en una proporción de 1:50, fotografiados el día 4 después de la incrustación. Los esferoides se trataron con (+Ab, panel derecho) o sin (-Ab, panel izquierdo) un anticuerpo bloqueador de E-cadherina. Barra de escala: 100 µm. b DI para células 4T1-mScar (cajas magenta) y 67NR-GFP (cajas verdes) de esferoides en (a). P = 2,78 × 10−5, <2,2 × 10−16 y 1,12 × 10−12 respectivamente, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. c Células Ecad-CTL, Ecad-KD1 y -KD2 en 2D. Se muestran la E-cadherina (verde, paneles inferiores) y los núcleos (grises, paneles superiores). d Densidad integrada de la señal de E-cadherina de las células en (c). P = 4,85 × 10−12 y <2,2 × 10−16, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. e Western-blot de expresión de E-cadherina en células Ecad-CTL, -KD1 y -KD2. La β-actina se usa como control de carga. f Número de hebras por esferoide (negro) y número de células individuales por esferoide (azul) para esferoides Ecad-CTL, -KD1 o -KD2. Los símbolos rojos vacíos indican valores cero. P = 9,01 × 10−10, 1,06 × 10−3 y 1,74 × 10−5, por la prueba t. g Esferoides mixtos, en una proporción de 1:50, fotografiados el día 4 después de la incrustación. Se usaron células Ecad-CTL, -KD1 o -KD2. Barra de escala: 100 μm. h DI para células Ecad-CTL, -KD1 y -KD2 (cajas magenta) y 67NR-GFP (cajas verdes) de esferoides en (g). P = 4,72 × 10−5, <2,20 × 10−16, 2,21 × 10−5, 2,12 × 10−15, 2,05 × 10−13 y <2,20 × 10−16, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Las transferencias Western sin recortar están disponibles en las Figs. complementarias. S14–S15.

Dado que la clasificación celular se produjo el día 3 después de la incrustación (Fig. 2a, d), y la acumulación de células 4T1 en el borde del esferoide se mantuvo durante la invasión 3D (Fig. 2i), razonamos que la interacción de las células 4T1 con el ECM puede ser crítico para mantener la clasificación celular. Para probar esto, colocamos esferoides mixtos en una matriz no adherente compuesta de agarosa. En los días 3 y 4, la DI fue similar tanto para las células 4T1 como para las células 67NR, lo que demuestra que las células incrustadas en agarosa no se clasificaron (Fig. 4a, b). El área del núcleo del esferoide fue similar tanto en el colágeno I como en las matrices de agarosa, lo que indica que la pérdida de clasificación celular fue independiente de la proliferación celular (Fig. S6a). Esta ausencia de clasificación celular podría deberse a que las células 4T1 no permanecen en el borde del esferoide sin la ECM adhesiva. Para probar esto en tiempo real, realizamos imágenes de lapso de tiempo de esferoides mixtos incrustados en agarosa y rastreamos células 4T1 individuales (Fig. 4c; Película S7). Descubrimos que el ΔDI promedio para las células ubicadas inicialmente en el compartimento del borde era negativo y cercano a cero para las células ubicadas inicialmente en el compartimento central (Fig. 4d). Esto indica que las células 4T1 se mueven desde el compartimiento del borde del esferoide hacia el compartimiento del núcleo (Película S8) y dentro del núcleo (Película S7). Esas células 4T1, que ingresan al compartimento del borde, lo abandonan posteriormente, lo que no se observó en los esferoides incrustados en la matriz de colágeno I (Película S9). Curiosamente, al calcular el MSD de las células en la dirección radial, encontramos que se mantuvo la diferencia en la persistencia entre las células 4T1 (superdifusiva, α> 1) y 67NR (difusiva, α = 1) (Figs. 4e y S6b– d), lo que sugiere que se requiere una interfaz ECM adhesiva para la clasificación de células.

a Esferoides mixtos en matriz de agarosa fotografiados el día 3 o 4 después de la inclusión. Barra de escala: 100 µm. b DI para células 4T1-mScarlet (cajas magenta) y 67NR-GFP (cajas verdes) de esferoides en (a). c Instantáneas de un lapso de tiempo de 44 horas de duración de un esferoide mixto cultivado en una matriz de colágeno I 3D. Las imágenes se tomaron a las 10 h (día 0,5) y 54 h (día 2,5) después de la incrustación. Para mayor claridad, solo se muestran las células 4T1-mScarlet. Se muestran trayectorias celulares representativas, codificadas por colores según el tiempo (paneles de la derecha). Consulte también Películas T7–9. Barra de escala: 100 µm. d ΔDI para células 4T1-mScarlet de esferoides en (c). P = 7,50 × 10−4, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Se muestra el exponente de la ley de potencia αr para las celdas 4T1-mScarlet (barras magenta) y 67NR-GFP (barras verdes) de los compartimentos del borde y del núcleo. f Esquema (izquierda) del ensayo de competencia 2D entre células y MEC y acercamiento a las células presentes en la interfaz de gelatina/poli-L-lisina (PLL) 24 h después del enchapado (panel superior derecho). Las células 4T1-mScarlet (panel inferior izquierdo) y 67NR-GFP (panel inferior derecho) se sembraron en placas solo en las islas de gelatina. Vea también la película S10. Barra de escala: 200 µm. g Porcentaje de células 4T1-mScarlet (cajas magenta) y 67NR-GFP (cajas verdes) en poli-L-lisina (PLL) de (f). h Esquema del ángulo de contacto (θ) (superior) y vistas ortogonales xz de células 4T1-mScarlet y 67NR-GFP en poli-L-lisina (PLL) o gelatina, 5 h después del enchapado. Barra de escala: 5 µm. i Ángulo de contacto θ para celdas de (h). PLL, 4T1 frente a 67NR: P = 1,25 × 10−9; 4T1, PLL frente a gelatina: P = 4,13 × 10−10, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.

Esto nos llevó a plantear la hipótesis de que, en comparación con las células 67NR, las células 4T1 se adhieren preferentemente a la MEC. Para comparar las propiedades adhesivas de las células 4T1 y 67NR con la ECM, desarrollamos un ensayo de competencia adhesiva de células-ECM 2D, en el que ambos tipos de células se colocaron en placas sobre islas de gelatina circulares (5,5 mm de diámetro), con poli-L-lisina. recubrimiento presente entre las islas (Fig. 4f). Después de 24 h, calificamos el número de células 4T1 y 67NR que migraron de las islas de gelatina a la región recubierta de poli-L-lisina. Encontramos que el 85% de las células presentes en la región de poli-L-lisina en el punto de tiempo de 24 h eran células 67NR (Fig. 4g). Para explicar esto, analizamos las películas de lapso de tiempo y vimos que en el raro caso de que las células 4T1 cruzaran de la gelatina al área de poli-L-lisina, las células terminaron migrando de regreso a la gelatina (Película S10). Nos preguntamos si esto podría explicarse porque las células 4T1 tienen una mayor fuerza de adhesión a la gelatina que las células 67NR. Para probar esto, medimos el ángulo de contacto de las células sembradas en gelatina o poli-L-lisina (Fig. 4h). Anteriormente se demostró que el ángulo de contacto entre la célula y la matriz aumenta con la fuerza de adhesión36. Descubrimos que ambos tipos de células tenían un ángulo de contacto similar cuando se colocaron en gelatina (Fig. 4i). Sin embargo, las células 4T1 sembradas en poli-L-lisina tenían un ángulo de contacto significativamente más bajo, mientras que las células 67NR exhibieron valores de ángulo de contacto similares tanto en gelatina como en poli-L-lisina (Fig. 4i, lo que indica que, en comparación con las células 67NR, las células 4T1 son más sensibles a la presencia de ECM. Esta afinidad por ECM está en línea con los niveles más altos de FAK y p-FAK observados en las células 4T1 que en las células 67NR (Fig. S6e). Al analizar los contactos célula-célula entre 4T1 y En las células 67NR sembradas en gelatina, encontramos que el porcentaje de contactos homotípicos fue similar en el momento de la siembra (0 h) y 24 h después de la siembra (Fig. S6f, g).Esto confirmó que las células 4T1 y 67NR no se clasificaron en 2D, lo que confirma una vez más que las adherencias diferenciales entre las células no son el principal impulsor de la clasificación celular en nuestro sistema, y ​​enfatiza el requisito de una interfaz célula-ECM para iniciar la clasificación celular35.

Después de la clasificación de las células 4T1 y 67NR en esferoides en los días 3 y 4, se produjo la invasión en los días 5 y 6 (Figs. 2a, 5a y S4c). Un mecanismo por el cual las células cancerosas pueden invadir colectivamente es la invasión cooperativa: las células líder invasivas crean micropistas dentro de la MEC, a través de las cuales pueden seguir las células no invasivas18,19,20,21. Dado que las células 4T1 y 67NR muestran habilidades invasivas diferenciales, razonamos que las células 4T1 podrían permitir la invasión cooperativa de las células 67NR no invasivas. Para probar esta hipótesis, analizamos los esferoides mixtos en el día 6 después de la incrustación. Observamos que las células 67NR no invasivas presentes en los esferoides mixtos ingresaron a la matriz de colágeno I (Fig. 5a). En consecuencia, encontramos que, en comparación con los esferoides de solo 67NR, los esferoides mixtos tenían una mayor cantidad de hebras por esferoide (Fig. 5b), y aproximadamente un tercio de las hebras contenían células 67NR (Fig. 5c). Es importante destacar que, en los esferoides mixtos, la mayoría de las hebras estaban dirigidas por células 4T1 (Fig. 5d), que ensamblan invadopodios (Fig. 1h). De acuerdo con la dependencia de MMP de las células 4T1 para la invasión (Fig. 1a), GM6001 bloqueó la invasión de esferoides mixtos (Fig. 4a-c). Durante la invasión cooperativa, la clasificación celular entre las células 4T1 y 67NR se mantuvo en las hebras invasivas, así como dentro del esferoide (Fig. 5e-g), con las células 4T1 recubriendo la interfaz de matriz esferoide. En general, estos hallazgos demuestran que la invasión cooperativa de esferoides mixtos en colágeno I depende de MMP, y las células 4T1 asumen la posición líder.

a Esferoides hechos de células 4T1-mScarlet y 67NR-GFP simples o mixtas (1:50), fotografiadas el día 6 después de la incrustación. Los esferoides se trataron con control de DMSO (paneles de la izquierda) o GM6001 (panel de la derecha). Barras de escala: 100 µm. Número de hebras por esferoide (b), el número de hebras que contienen células 67NR (67NR + ) (c) y el porcentaje de hebras dirigidas por células 4T1-mScarlet (cajas magenta) o 67NR-GFP (cajas verdes) (d) para esferoides simples o mixtos (caja blanca) de (a). Los símbolos rojos vacíos indican valores cero. P = 1,90 × 10−7 (b) y 9,86 × 10−6 (c), según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. e Corte mediano de esferoides mixtos de (a). Barras de escala: 100 µm. f Coordenadas de las células 4T1-mScarlet (magenta) y 67NR-GFP (cruces verdes) de esferoides mixtos en (e). Las células presentes en las cadenas se excluyeron (panel izquierdo) o se incluyeron (panel central) en el análisis. g DI para células 4T1-mScarlet (magenta) y 67NR-GFP (verde) de esferoides en (e, f). P < 2,20 × 10−16 y <2,20 × 10−16, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. h Esferoides de células Ecad-CTL, -KD1 o -KD2 mezcladas con 67NR en una proporción de 1:50, fotografiadas el día 6 después de la incrustación. Barra de escala: 100 μm. Número de hebras (i) y número de hebras que contienen células 67NR-GFP (67NR+) (j) para esferoides de (h). P = 0,02 y 6,1 × 10−5 en (i); 0,00073 y 8,70 × 10−8 en (j), mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. k Número de células individuales encontradas fuera del núcleo del esferoide, para esferoides de (h). P = 0,02 y 6,1 × 10−5.

Nuestros resultados hasta ahora sugieren que la degradación de ECM mediada por 4T1 es necesaria para que las células 67NR entren en la matriz de colágeno I. Presumimos que la presencia de células 4T1 en la matriz de colágeno I es necesaria y suficiente para degradar el colágeno y crear micropistas. Para confirmar esto, en lugar de premezclar células 4T1 con células 67NR en un esferoide, incrustamos esferoides 67NR en una matriz de colágeno I poblada por células 4T1. De manera similar a nuestras observaciones en esferoides mixtos, encontramos que en presencia de células 4T1 en la matriz de colágeno I, las células 67NR invadieron la matriz y que esta invasión dependía de MMP (Fig. S7a, b). Para excluir la posibilidad de que las MMP solubles liberadas por las células 4T1 facilitaran la invasión de las células 67NR en la matriz de colágeno I, cultivamos esferoides de células 67NR con medio acondicionado de células 4T1. Descubrimos que proporcionar medio acondicionado de células 4T1 a células 67NR no fue suficiente para que las células 67NR invadieran la matriz de colágeno I (Fig. S7c, d). En esferoides mixtos, identificamos micropistas dentro de la matriz de colágeno I, llenas de células 4T1 a la cabeza y células 67NR a continuación (Fig. S7e). El informe anterior de una invasión cooperativa heterotípica entre fibroblastos asociados con el cáncer y células cancerosas epiteliales ha demostrado la participación de adherencias heterotípicas de N-cadherina/E-cadherina37. No detectamos uniones heterotípicas de E-cadherina/N-cadherina entre las células 4T1 y 67NR (Fig. S8a-c), lo que sugiere que la invasión cooperativa entre estas células no dependía de las interacciones de E-/N-cadherina. En general, nuestros datos sugieren que las células 4T1 degradan la matriz de colágeno I y las células 67NR se mueven hacia las micropistas creadas por las células 4T1.

Nos preguntamos si la inhibición de la E-cadherina, que no tuvo efecto en la clasificación celular (Fig. 3f, g), puede afectar la invasión cooperativa. Para probar esto, tomamos imágenes de los esferoides 4T1, Ecad-CTL, -KD1 y -KD2 el día 6, cuando ocurre la invasión (Fig. 5h). Mientras que la línea celular Ecad-KD1 mostró una transición parcial de la invasión colectiva a la unicelular, con hebras invasivas y células invasivas individuales, se observó una transición completa a la invasión unicelular para Ecad-KD2. De manera similar, en los esferoides mixtos que contenían células 67NR con Ecad-CTL o -KD, mientras que las células Ecad-CTL y Ecad-KD1 formaban hebras invasivas, ambas líneas celulares Ecad-KD exhibieron invasión de células individuales (Fig. 5i-k). Para cuantificar las ocurrencias de invasión cooperativa en modos de invasión de células individuales y colectivas, medimos la cantidad de seguidores 67NR presentes en hebras (Fig. 5j) o como células individuales (Fig. 5k). Nuestros resultados demuestran que, si bien 67NR puede seguir a las células Ecad-KD1, que mantienen hebras invasivas (Fig. 5i), en presencia de una transición completa a la invasión de una sola célula, como en esferoides mixtos de Ecad-KD2 y 67NR, se pierde la invasión cooperativa. (Figura 5k).

Dado que se requiere la degradación de ECM mediada por 4T1 para la invasión cooperativa (Figs. 4 y S6), y que la célula líder 4T1 ensambla invadopodios (Fig. 1h), nos preguntamos si específicamente el ensamblaje de invadopodios por células 4T1 era responsable de la degradación de ECM. Para confirmar rigurosamente que se requiere la función de los invadopodios para la invasión cooperativa de las células cancerosas, eliminamos de forma estable los invadopodios en las células 4T1-mScarlet, utilizando una eliminación de Tks5 de ratón (Tks5-KD)13, y establecimos la línea celular de control correspondiente (Tks5-CTL). (Fig. 6a, arriba, 78,1% de eficiencia de eliminación). También verificamos que las líneas celulares Tks5-CTL y Tks5-KD aún expresaban E-cadherina (Fig. 6a, abajo), que estaba localizada en las uniones entre las células Tks5-CTL y Tks5-KD en esferoides (Fig. S9a, b) . Confirmamos mediante un ensayo de degradación de gelatina en 2D y un ensayo de invasión de esferoides en 3D que las células Tks5-KD perdieron su capacidad invasiva (Fig. 6b-e). Luego realizamos el ensayo de invasión de esferoides de esferoides mixtos que contienen células Tks5-CTL y Tks5-KD. En el día 2 posterior a la incorporación, encontramos que tanto las células Tks5-CTL como las células Tks5-KD no invasivas habían ingresado a la matriz de colágeno I (Fig. 6d). Los esferoides mixtos tenían una cantidad similar de cadenas que Tks5-CTL (Fig. 6e), y la mayoría de las cadenas contenían ambos tipos de células (Fig. 6f) y estaban dirigidas por células Tks5-CTL (Fig. 6g). Para probar si la invasión cooperativa era específica del tipo de célula, elegimos la línea celular humana metastásica MDA-MB-231, que no expresa E-cadherina y ensambla invadopodios13 funcionales. Al derribar Tks5 humano en células MDA-MB-231 (Fig. S10a-c), observamos que las células sin invadopodios podían seguir a las células con invadopodios, a través de la invasión cooperativa (Fig. S10d-g), fortaleciendo nuestros resultados. Para probar aún más la importancia de los invadopodios en la invasión cooperativa de células cancerosas, generamos esferoides mixtos Tks5-KD y 67NR-GFP. Aquí, no observamos hebras invasivas (Fig. 6h, i). Finalmente, validamos la conclusión con una secuencia de shRNA Tks5 diferente, Tks5-KD2, que proporcionó resultados similares a Tks5-KD (Fig. S11). En general, demostramos que se requieren invadopodios funcionales en las células líder durante la invasión cooperativa, mientras que las células seguidoras pueden carecer de invadopodios.

una expresión de Tks5 (arriba) y E/N-cadherina (abajo) en células Tks5-CTL y Tks5-KD. b Degradación de gelatina por Tks5-CTL (panel superior) y Tks5-KD (panel inferior), 18 h después de la siembra. Las inserciones muestran un aumento de 2X del área encuadrada y las puntas de flecha indican una degradación representativa. Barra de escala: 20 μm. c Área de degradación por celda para las células Tks5-CTL y Tks5-KD de (b). P < 2,2 × 10−16, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. d Imágenes del día 2 de esferoides fabricados con células Tks5-CTL, -KD o una mezcla de células Tks5-CTL y -KD (proporción 1:1). Barra de escala: 100 μm. Número de hebras por esferoide (e), número de hebras que contienen células Tks5-KD (f) y porcentaje de hebras dirigidas por células Tks5-CTL y -KD (g) en esferoides de (d). P = 1,54 × 10−7 y 2,89 × 10−5, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon en (e). P = 6.69 × 10−11, por la prueba t en (f). h Imágenes del día 6 de esferoides mixtos (proporción 1:50) hechos de células 67NR-GFP y 4T1-mSCarlet (4T1-mScar) o Tks5-KD. Barras de escala: 100 μm. i Número de hilos por esferoide de (h). P = 3,36 × 10−6, según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. j Tumor mixto 4T1-mScarlet y 67NR-GFP, marcado con DAPI (azul). Barra de escala: 50 μm. k Número de colonias de pulmón por cm2 para ratones inoculados con células 4T1, 67NR, Tks5-CTL o Tks5-KD. Los símbolos rojos vacíos indican valores cero. P = 0,032, mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. l Número de colonias de pulmón por cm² para ratones inoculados con células 67NR individuales o mezcladas con células 4T1; y células Tks5-KD individuales, o mezcladas con células Tks5-CTL. Los símbolos rojos vacíos indican valores cero. P = 0,032, mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Las transferencias Western sin recortar están disponibles en las Figs. complementarias. S16–S18.

También probamos si la eliminación de invadopodios afectó la clasificación celular. Como era de esperar, la clasificación celular no ocurrió en esferoides mixtos de células Tks5-CTL y Tks5-KD (Fig. S12a), pero sí ocurrió en esferoides que contenían células Tks5-KD y 67NR-GFP (Fig. S12b). Estos hallazgos confirmaron que los invadopodios no son necesarios para la clasificación de células. Dado que las células Tks5-CTL y Tks5-KD muestran motilidad similar y propiedades de adhesión celular-ECM (Fig. S12c, d), estas observaciones también fortalecen el requisito de motilidad diferencial y sensibilidad diferencial de célula-ECM para que se produzca la clasificación celular. De acuerdo con esto, la clasificación celular no ocurrió en esferoides que contenían células 4T1-mScarlet y 4T1 de tipo salvaje (Fig. S12e, f).

La diseminación y la metástasis requieren la migración transendotelial de las células cancerosas, es decir, la intravasación y la extravasación, que previamente se demostró que dependen de los invadopodios13,38. Mientras que la MEC intersticial en el tumor primario y los tejidos circundantes puede remodelarse permanentemente mediante la formación de micropistas39, la migración transendotelial implica una apertura breve y transitoria de la MEC perivascular40. No se sabe si las células invasivas y no invasivas también pueden cooperar durante la metástasis. Para investigar si las células con invadopodios podrían permitir la metástasis de células sin invadopodios, generamos tumores con líneas celulares únicas o mixtas. Después de que los tumores alcanzaran los 6-9 mm de diámetro, realizamos el ensayo clonogénico pulmonar en los tejidos digeridos. Para determinar qué tipo de célula estaba desarrollando colonias pulmonares metastásicas, aprovechamos las diferencias en la expresión de proteínas fluorescentes o la sensibilidad a los fármacos. Confirmamos que la caída de Tks5 se mantuvo en los tumores Tks5-KD (Fig. S11i). Descubrimos que las líneas celulares Tks5-KD, en el fondo 4T1 o MDA-MB-231, y las células 67NR no eran capaces de metástasis pulmonar, en contraste con las células de control y de tipo salvaje (Figs. 6k y S10i, S11j). Cuando se inyectaron simultáneamente células 4T1 y 67NR, 67NR no hizo metástasis (Fig. 6l). Esto no se debió a que las células 4T1 se hicieran cargo, ya que las células 67NR estaban presentes en el tejido tumoral (Fig. 6j). De manera similar, la inyección conjunta de control MDA-MB-231 y su correspondiente eliminación de Tks5, D2-KD, demostraron que solo las células de control eran capaces de metástasis (Fig. S10h, i). Curiosamente, cuando se inyectaron conjuntamente Tks5-KD con células Tks5-CTL, se observaron ambos tipos de células en los pulmones (Fig. 6l), lo que sugiere que se ha producido una metástasis cooperativa. Colectivamente, estos resultados implican la dependencia de la metástasis cooperativa de los invadopodios y de la expresión de E-cadherina y/o la presencia de uniones célula-célula.

En este estudio, mostramos que las células invasivas pueden separarse y liderar células no invasivas durante la invasión cooperativa y la metástasis. Al examinar los movimientos celulares en los esferoides, demostramos que la persistencia diferencial y la sensibilidad de ECM impulsan la clasificación celular entre clones. A través de la eliminación de invadopodios, al silenciar Tks5, demostramos que las células con invadopodios conducen a las células sin invadopodios en una invasión cooperativa y permiten su metástasis.

Confirmamos las observaciones informadas anteriormente de que las células 4T1 invasivas se encuentran en un estado híbrido epitelial/mesenquimatoso, mientras que las células 67NR no invasivas son mesenquimales27,28,29. Anteriormente se demostró que la expresión de Twist, que es necesaria para los invadopodios8, está presente en las células 4T1 pero no en las células 67NR41. Por lo tanto, la EMT mediada por Twist podría ser responsable de las diferencias en las habilidades de invasión entre las células 4T1 y 67NR41. Dado que las células 4T1 pero no las células 67NR ensamblan invadopodios funcionales, parece que se requiere una trayectoria EMT específica que otorga invadopodios, en lugar de la finalización de EMT para la aparición de invadopodios. Nuestros resultados están en línea con la evidencia reciente de que las células epiteliales3,42 y las células híbridas epiteliales/mesenquimatosas pueden hacer metástasis, a veces de manera más eficiente que las células mesenquimatosas43,44.

A pesar de expresar los componentes centrales de invadopodios cortactin y Tks5, las células 67NR no logran degradar la matriz. Sin embargo, las células 67NR carecen de MMP-2 y MMP-9 activas, probablemente debido a que la proteasa MMP-14 (también conocida como MT1-MMP), comúnmente encargada de activar MMP-2 y MMP-9, no está funcionando o no. siendo entregado a la membrana plasmática45,46.

Aquí, descubrimos el papel de la persistencia diferencial y la sensibilidad celular-ECM en el establecimiento de la clasificación celular en el cáncer. Los estudios clásicos sobre la clasificación celular durante el desarrollo mostraron que la clasificación celular generalmente se basa en la fuerza diferencial de las adherencias célula-célula35, o en las diferencias en la contractilidad47. En contradicción con estos puntos de vista, mostramos que las células 4T1 y 67NR no se ordenaron en una capa de gelatina 2D, o cuando se colocaron en una matriz de agarosa 3D. La importancia de la motilidad diferencial en la clasificación se sugirió previamente durante el patrón de tejido48 y en los túbulos mamarios diseñados, donde se demostró que se acumulan más células epiteliales direccionales en el borde del tejido49. Durante la autoorganización de los conductos mamarios, se informó que la presencia de interacciones binarias entre células y MEC (activadas o desactivadas) regulan la clasificación celular36. Similar a nuestras observaciones, Pawlizak et al. demostraron recientemente que la clasificación de las líneas celulares de mama que expresan E-, N- o P-cadherina no podía explicarse mediante la hipótesis de adhesión diferencial50. Curiosamente, los autores propusieron que la motilidad podría ser responsable de la clasificación celular.

Encontramos que en los esferoides donde las células invasivas altamente persistentes sensibles a ECM se mezclan con células no invasivas que se mueven aleatoriamente, la clasificación y acumulación de células invasivas en la interfaz esferoide-ECM precede a la invasión cooperativa. Esto enfatiza la importancia de estudiar los mecanismos que regulan la organización espacial de las células líder y seguidora. La acumulación de células líder en la interfaz de matriz esferoide puede mejorar la velocidad y la eficiencia de la invasión cooperativa. Apoyando estos puntos de vista, un estudio reciente demostró que la clasificación celular precede a la extrusión basal de las células epiteliales mamarias51. Es importante destacar que, si bien la clasificación celular puede ser catalítica, no parece ser esencial para la metástasis cooperativa en nuestro sistema. Mientras que las células mixtas 4T1 Tks5-KD y Tks5-CTL participan en metástasis cooperativa, pero no se clasifican, las mezclas de células 4T1 y 67NR se clasifican pero no metastatizan cooperativamente.

Desde el descubrimiento de la invasión cooperativa, se ha llevado a cabo un trabajo significativo para descubrir los mecanismos por los cuales las poblaciones heterogéneas de células de cáncer de mama interactúan y se movilizan colectivamente. Nuestro trabajo sugiere que la actividad de los invadopodios es un factor determinante del fenotipo de la célula líder. Anteriormente mostramos que la fase G1 del ciclo celular también es un factor determinante de la identidad de la célula líder22. De acuerdo con este trabajo actual, también habíamos demostrado que los invadopodios se enriquecen en la fase G1 del ciclo celular22. Un estudio diferente reveló que las células que lideran las hebras de invasión poseen una mayor energía intracelular en comparación con las células seguidoras17. En conjunto, parece que el ciclo celular, la energía intracelular y la función de los invadopodios son determinantes de la identidad de la célula líder. Sin embargo, la interacción entre el ciclo celular, la energía intracelular y la función de los invadopodios aún debe investigarse en el contexto de la aparición de líderes y seguidores dentro de una población celular.

En resumen, nuestro estudio sugiere que la cooperatividad entre clones de cáncer puede ser un mecanismo eficaz para la metástasis colectiva. Específicamente, demostramos que los invadopodios permiten la metástasis cooperativa y permiten la metástasis de células no invasivas. Nuestros hallazgos sobre la metástasis cooperativa de 4T1 Tks5-KD con Tks5-CTL están alineados con la demostración anterior de diseminación de grupos de células epiteliales3. Por el contrario, las células 67NR no hacen metástasis de manera cooperativa cuando se mezclan con 4T1. Además, las células MDA-MB-231 Tks5-KD (D2-KD) no hacen metástasis de manera cooperativa con las células MDA-MB-231. Ambas líneas celulares carecen de E-cadherina, lo que sugiere que la metástasis cooperativa depende de fuertes interacciones célula-célula basadas en E-cadherina. Curiosamente, la invasión cooperativa en el ensayo de esferoides 3D no plantea tal requisito, ya que las células 67NR y D2-KD siguen con éxito a sus contrapartes invasivas. La razón probable es que las deformaciones del colágeno generadas por las células líder invasivas son plásticas (permanentes), lo que permite que hebras de células o células individuales migren a través de ellas39. Por el contrario, las deformaciones que las células líder generan en la pared del vaso sanguíneo son elásticas (transitorias), y las seguidoras pueden cruzar las paredes de los vasos sanguíneos solo si exhiben fuertes adherencias célula-célula al líder.

Nuestros hallazgos demuestran que las células cancerosas participan en la metástasis cooperativa, que puede ser más perjudicial que la metástasis de células individuales. Proponemos que dirigirse a los invadopodios podría ser una estrategia potente para inhibir la metástasis tanto de células invasoras individuales13,14 como colectivas.

Todos los experimentos en ratones (Mus musculus) se realizaron de acuerdo con las regulaciones de los NIH y fueron aprobados por el protocolo IACUC de la Universidad de Temple número 4766.

Los dispositivos de imágenes de esferoides (SID) se fabricaron como se describió anteriormente33. Brevemente, los SID se hicieron uniendo discos de poli-dimetil-siloxano (PDMS) a los platos con fondo de vidrio (MatTek Corporation). Cada disco PDMS mide 17,5 mm de diámetro y contiene tres pocillos de 5,5 mm de diámetro, adecuados para esferoides individuales.

Se recubrieron placas de 6 pozos con gelatina como se describió anteriormente52. Brevemente, cada pocillo se cubrió con una solución de gelatina al 2,5 % durante 10 min, seguido de un tratamiento con glutaraldehído al 0,5 % (Sigma-Aldrich) durante 10 min, en hielo, y 30 min más a temperatura ambiente. Las placas se esterilizaron con etanol al 70% y luego 50 U/mL de penicilina - 50 µg/mL de tratamiento con estreptomicina.

Las líneas celulares isogénicas de cáncer de mama murino 4T1 y 67NR fueron obsequios del Dr. Fred R. Miller del Karmanos Cancer Center y del Dr. Jin Yang de la UCSD. La línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (HTB-26) se obtuvo de la American Type Culture Collection. La línea celular MDA-MB-231-Dendra2-hTks5 KD se describió previamente y se mantuvo bajo una presión continua de 0,5 µg/ml de puromicina y 500 µg/ml de geneticina13. Todas las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco [4,5 g/L D-glucosa, L-glutamina] (DMEM, Gibco), suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Atlanta Biologicals) y 50 U/mL de penicilina - 50 µg /ml de estreptomicina (Gibco). Los cultivos celulares se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2 durante un máximo de 60 días.

Las líneas celulares 4T1-mScarlet y 67NR-GFP se generaron por transfección utilizando una proporción 1:4 de ADN plasmídico:reactivo FugeneHD (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, seguido de selección con 500 µg/mL de geneticina (Fisher BioReagents) y 3 µg/ml de puromicina (MP Biomedicals), respectivamente. pmScarlet-H-C1 fue un regalo de Dorus Gadella (plásmido de Addgene n.° 85043). pEGFP-puro fue un regalo de Michael McVoy (plásmido de Addgene n.° 45561). La línea celular MDA-MB-231-mScarlet se generó por electroporación (Lonza) del plásmido pmScarlet-C1, según las instrucciones del fabricante, y selección con 500 µg/ml de geneticina. Después de dos semanas de selección de fármacos, se clasificaron las células (BD FACSAriaIIµ, BD Biosciences), recogiendo las subpoblaciones que expresaban altos niveles de mScarlet o GFP.

Las líneas celulares de eliminación Tks5-KD y -KD2, E-cadherina-KD1 y -KD2, y las líneas celulares de control de eliminación Tks5-CTL, Ecad-CTL y MDA-MB-231-mScarlet-CTL se generaron por transducción del 4T1. -líneas celulares mScarlet, 4T1 y MDA-MB-231-mScarlet, respectivamente, con partículas lentivirales (3 partículas virales/célula) que contienen shRNA dirigido a mTks5 (ID de clon: TRCN0000105733, CGTGGTGGTGTCCAACTATAA; ID de clon: TRCN0000105734, CCTCATACATTGACAAGCGCA), hTks5 descrito anteriormente13 , o E-cadherina (KD) (ID de clon: TRCN0000042581, CCGAGAGAGTTACCCTACATA; ID de clon: TRCN0000042579, CGGGACAATGTGTATTACTAT) o shRNA no dirigido (CTL) en el vector pLKO.1-puro (biblioteca MISSION, Sigma-Aldrich), y selección con 2 µg/mL de puromicina 3-7 días después de la infección. Se analizaron transferencias Western para confirmar las eficiencias de KD. Además, imágenes de Ecad-CTL y Ecad-KDs inmunomarcadas con E-cadherina y segmentadas usando Cellpose. Se superpusieron máscaras sobre la imagen y se cuantificó la densidad integral por celda.

Se usó tinción con cristal violeta para evaluar el efecto de la mitomicina C sobre la proliferación de la línea celular 4T1. Brevemente, las células 4T1 se sembraron en una placa de 6 pocillos y al día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó con medio de cultivo que contenía 0,5 µg/ml de mitomicina C (resuspendida en DMSO, Cayman Chemical). Después de 2 días, las células se lavaron con PBS frío, se fijaron con metanol al 100 % enfriado con hielo durante 10 min y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,5 % en metanol al 25 % durante 10 min a temperatura ambiente. El exceso de tinte se eliminó mediante varios lavados con agua del grifo y la placa se secó al aire durante la noche a temperatura ambiente. El colorante se solubilizó utilizando metanol al 100 % durante 20 min y la densidad óptica se leyó en un lector de placas a 570 nm. La densidad óptica a 570 nm para las células tratadas con mitomicina C se informó de la densidad óptica a 570 nm para las células tratadas con DMSO.

La gelatina se marcó con fluorescencia con éster Alexa-405-NHS y los platos con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek Corporation) se recubrieron con gelatina Alexa-405 como se describió previamente31. Se sembraron 400 000 (4T1/67NR) o 300 000 (MDA-MB-231) células por placa y las células se fijaron 18 h más tarde con paraformaldehído al 4 % (Alfa Aesar) durante 10 min, permeabilizadas con Triton X-100 al 0,1 % (Calbiochem) durante 5 min, bloqueado con FBS al 1 %/BSA al 1 % (Sigma-Aldrich) en PBS (Gibco) durante 3 h, incubado con anticuerpo anti Tks5 (Millipore, MABT336) durante 2 h, luego con anticuerpo secundario y faloidina Alexa Fluor 633 (Invitrogen) durante 1 h.

Se tomaron imágenes de las muestras en un microscopio confocal de barrido láser (FV1200, Olympus) utilizando un objetivo 60X (UPLSAPO60XS, 1,35 NA, Olympus). Las pilas se recogieron en un paso z de 1 µm. Para cuantificar la degradación de la matriz, las imágenes se procesaron utilizando una macro personalizada en Fiji. Brevemente, los cortes de la pila se proyectaron en z usando el método de intensidad máxima, seguido de la determinación del umbral de la señal en el canal de gelatina, usando el algoritmo de umbral automático y midiendo el área de los puntos de degradación usando la herramienta de análisis de partículas. Para tener en cuenta las diferencias en la densidad de células en los campos de visión, el área total de degradación en un campo de visión se dividió por el número total de células presentes en este campo de visión. Las células se contaron utilizando la tinción de F-actina.

Las placas de 6 pocillos se recubrieron con 50 µg/ml de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) durante 20 min y se secaron al aire. Las células se sembraron en placas y se cultivaron hasta la confluencia antes de usar una punta de pipeta de 10 µl para crear una herida en forma de cruz a través de la monocapa. Se tomaron imágenes de las muestras en un microscopio de campo amplio (IX-81, Olympus) equipado con una lámpara LED (Excelitas Technologies), una cámara de dispositivo acoplado por carga Orca de 16 bits (Hamamatsu), una compensación automatizada de deriva z IX3-ZDC (Olympus) , una platina automatizada (Prior Scientific), una cámara ambiental (Live Cell Instrument) y usando un objetivo 10X (MPlanFL N 10X, 0.3 NA, Olympus). La motilidad celular se registró a intervalos de 10 min durante 48 h. El seguimiento celular manual se realizó utilizando el complemento TrackMate a través de Fiji53. Se exportaron el número de pista, las coordenadas del punto y el número de cuadro. El cálculo de la velocidad y la persistencia se realizó utilizando un código Matlab personalizado.

Para generar islas de gelatina, utilizamos los insertos de PDMS (consulte Fabricación de dispositivos de imágenes de esferoides (SID)). Brevemente, se recubrieron platos con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek Corporation) con 50 µg/ml de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) durante 20 min y se secaron al aire. Luego, los anillos de PDMS se colocaron suavemente sobre el vidrio y se sellaron presionando suavemente hacia abajo. A continuación, cada orificio de 5,5 mm de diámetro se recubrió con gelatina marcada con fluorescencia como se describió anteriormente31 (consulte el ensayo de degradación de gelatina 2D). Se sembraron células 4T1-mScarlet y 67NR-GFP en cada orificio en una proporción de 1 a 1. Se permitió que las células se adhirieran durante 1 h, después de lo cual los insertos de PDMS se despegaron suavemente del vidrio y se agregó el medio a los platos. Finalmente, las células se fijaron 24 h después con paraformaldehído al 4% (Alfa Aesar) durante 10 min.

Se tomaron imágenes de las muestras en un microscopio de campo amplio (Eclipse Ti2-E, Nikon) equipado con una cámara pco.panda sCMOS (PCO) y usando un objetivo 10X (CFI Plan Fluor 10X, 0.3 NA, Nikon). Se adquirieron mosaicos (6 × 6) para visualizar toda la superficie de la isla de gelatina. Se obtuvieron imágenes de células vivas cada 10 min y usando una cámara ambiental (Tokai Hit). La película se anotó con el complemento DrawArrowInMovie Fiji54. Para cuantificar el ensayo de competencia adhesiva de ECM de células 2D, contamos el número de células 4T1 y 67NR que migraron de las islas de gelatina. Para cuantificar la clasificación de células en 2D, solo utilizamos regiones cubiertas con gelatina y contamos el número de vecinos homotípicos.

La medición del ángulo de contacto se realizó como se describió previamente36. Brevemente, se recubrieron platos con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek Corporation) con gelatina marcada con fluorescencia como se describió previamente31 o con 50 µg/ml de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) durante 20 min y se dejaron secar al aire. Se dejó que las células se adhirieran durante 5 h antes de obtener la imagen. Se tomaron imágenes de células solitarias, que no tenían interacción física con las células cercanas, en un microscopio confocal de barrido láser (FV1200, Olympus) usando un objetivo 60X (UPLSAPO60XS, 1.35 NA, Olympus) equipado con una cámara ambiental (In Vivo Scientific), con un Paso z de 1 µm. Se utilizaron vistas ortogonales para medir el ángulo entre el ECM y el cuerpo principal de la celda: el ángulo de contacto.

Para las líneas celulares 4T1 y 67NR, se generaron esferoides 3D mediante el método de gota colgante. Se colocaron 3000 células por gota de 40 µl que contenían 4,8 mg/ml de metilcelulosa (Sigma-Aldrich), 20 µg/ml de Nutragen (Advanced Biomatrix) en la tapa de las placas de cultivo de tejidos. Las tapas se giraron con cuidado y se colocaron en el depósito inferior de los platos llenos de PBS para evitar la evaporación. Como alternativa, para las líneas celulares MDA-MB-231, se generaron esferoides 3D en una placa con fondo en V de 96 pocillos recubierta con poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) al 0,5 % (Sigma-Aldrich) en etanol. Luego, se distribuyeron 5000 células en 50 µl de medio a cada pocillo y la placa se centrifugó durante 20 min a 1000 × g ya 4 °C. Finalmente, se añadieron a cada pocillo 50 µl de Matrigel (Corning) a una concentración final del 2,5%. Los esferoides se formaron durante 3 días a 37 °C y 5 % de CO2, se incluyeron en 30 µl de colágeno I de cola de rata de 5 mg/ml (Corning, protocolo de gelificación alternativo) y se colocaron en los SID. El colágeno I se polimerizó a 37 °C durante 30 min y luego se agregó medio de cultivo a las placas. Para los tratamientos farmacológicos, se utilizó medio de cultivo celular que contenía GM6001 25 µM (resuspendido en DMSO, Cayman Chemical), Y-27632 10 µM (resuspendido en DMSO, Cayman Chemical) o control de DMSO al 0,1%.

Para los experimentos en los que las células 4T1-mScarlet rodean los esferoides 67NR-GFP, se agregaron células 4T1-mScarlet a la mezcla de colágeno que contenía los esferoides 67NR-GFP a 106 células/mL antes de la polimerización del colágeno.

Para los experimentos en los que se utilizó medio acondicionado, se sembraron células 4T1-mScarlet en una placa de 6 pocillos recubierta de gelatina, a razón de 2 × 106 células/pocillo. Se usaron 2 ml de DMEM completo por pocillo y los esferoides 67NR-GFP incrustados se cultivaron, desde el día 0, usando el medio acondicionado de las células 4T1-mScarlet sembradas en gelatina. Cada dos días, se reemplazó el medio acondicionado.

El colágeno se marcó como se describió previamente55, utilizando 2 µg/ml de 405-Alexa-NHS éster (Biotium).

Para bloquear la E-cadherina, se usaron 5 μg/ml del anticuerpo bloqueador (MABT26, Millipore) para romper las adherencias célula-célula. Los esferoides de Ecad-KD se generaron como se describió anteriormente19. Brevemente, las células se tripsinizaron y se resuspendieron a 1,5 × 104 células/ml en medio DMEM F12 completo (5 % de suero de caballo, 0,5 µg/ml de hidrocortisona, 20 ng/ml de hEGF, 10 µg/ml de insulina, 100 ng/ml de toxina del cólera , penicilina/estreptomicina al 1 %) y metilcelulosa al 0,25 % (Sigma-Aldrich). La suspensión celular se sembró en placas de 96 pocillos de fondo redondo no adhesivas (Corning), 200 µl/pocillo. La placa se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente y se colocó en el agitador orbital a 37 °C, 5 % de CO2 durante 2 h. El medio se reemplazó con un DMEM F12 completo que contenía metilcelulosa al 0,25 % (Sigma-Aldrich) y Matrigel al 1 % (Corning). Se formaron esferoides en la incubadora durante 48 h.

El marcaje por inmunofluorescencia se realizó como se describió previamente33. Brevemente, los esferoides incrustados se fijaron y permeabilizaron simultáneamente en paraformaldehído al 4 % y Triton X-100 al 0,5 % en PBS durante 5 min, luego se fijaron en paraformaldehído al 4 % en PBS durante 20 min y se bloquearon en FBS al 1 %/BSA al 1 % en PBS. a 4 °C durante 24 h en un agitador. Luego, los esferoides incrustados se incubaron con anti-colágeno I ¾ (immunoGlobe, 0207-050; 1 a 100), anti-E-cadherina (Invitrogen, 13-1900; 1 a 100), anti-N-cadherina (BD Transduction Laboratories, 610920; 1 a 100) y anti Tks5 (Millipore, MABT336; 1 a 100) durante la noche a 4 °C y con anticuerpos secundarios y Alexa Fluor 633 Phalloidin (Invitrogen; 1 a 250) durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador.

Se tomaron imágenes de los esferoides usando un microscopio confocal de escaneo láser (FV1200, Olympus) con un objetivo 10X (UPLXAPO10X, 0.4 NA, Olympus) o 30X (UPLSAPO30XSIR, 1.05 NA, Olympus), usando un paso z de 3–5 µm. Para cuantificar el área total del esferoide, los esferoides se marcaron con DAPI. Las imágenes se procesaron utilizando una macro personalizada en Fiji. Brevemente, los cortes se proyectaron en z utilizando el método de intensidad máxima y los núcleos se seleccionaron utilizando el algoritmo de umbral automático de Fiji. Luego, se utilizó la herramienta de Análisis de Partículas para medir el área total de los núcleos.

Para cuantificar la señal de E-cadherina, los cortes de interés se proyectaron en z utilizando el método de intensidad máxima y se identificaron hebras o células individuales. Para la relación relativa unión/citosol: se dibujó una línea de 10 µm de largo y se centró en la unión entre dos células dentro de una hebra. El valor gris a lo largo de la línea se midió para el canal E-cadherina y F-actina utilizando la herramienta Plot Profile. El valor gris a 0 y 5 µm se definió como la señal de "citosol" y "unión", respectivamente.

Para cuantificar la clasificación de celdas, las imágenes se procesaron utilizando una macro personalizada en Fiji. Dado que la proyección máxima de los cortes en z introduce artefactos en las posiciones de las células, con respecto al borde del esferoide frente a los compartimentos centrales, utilizamos solo el corte mediano de la pila en z. Brevemente, el segmento mediano se extrajo de la pila z y el núcleo esferoide se seleccionó en el canal de campo claro utilizando el algoritmo de umbral automático de Fiji. Luego, utilizando las opciones Ajustar elipse y Centroide en Medidas, se extrajeron las coordenadas del centro del núcleo del esferoide y el eje principal del núcleo del esferoide. Finalmente, se utilizó la herramienta Multipunto para registrar las coordenadas de las celdas GFP+ y mScarlet+. La clasificación de células se cuantificó como la distancia desde el centro del esferoide hasta la célula (d en la Fig. 2c) sobre el semieje mayor del esferoide (a en la Fig. 2c). Definimos esta relación como el "Índice de distancia" (DI). Alternativamente, para esferoides mixtos que contenían células no marcadas, como Tks5-CTL (Fig. 6) o células de tipo salvaje 4T1 (Fig. S12), se usó la tinción DAPI para medir la coordenada de una celda. Para una celda rastreada dada, definimos el ΔDI como el DI para su posición final menos el DI para su posición inicial.

Las imágenes en vivo de esferoides se realizaron longitudinalmente (diariamente), para analizar la clasificación de células, o mediante lapso de tiempo, para analizar la motilidad celular. Se utilizó un microscopio confocal (FV1200, Olympus) con un objetivo 10X (UPLXAPO10X, 0.4 NA, Olympus) equipado con una cámara ambiental (instrumento Live Cell). La motilidad celular se registró a intervalos de 10 o 20 min durante 44 h, con un paso z de 15 µm. Solo se usaron para el seguimiento cortes en los que tanto las celdas del núcleo como los compartimentos del borde eran visibles. El seguimiento de celdas se realizó utilizando el complemento TrackMate a través de Fiji53. La detección puntual se realizó utilizando el detector LoG con filtrado de mediana y localización de subpíxeles. Luego, se usó el rastreador LAP de movimiento lineal para vincular los puntos. Las pistas se filtraron en función del número de puntos en la pista con un corte de ≥ 5 puntos/pista. Las pistas se validaron visualmente y se corrigieron si era necesario, utilizando la herramienta TrackScheme. Finalmente, se cerraron las brechas en las pistas mediante la introducción de nuevos lugares. La posición de los nuevos puntos se calculó mediante interpolación lineal. Para cada pista, se midió la distancia desde el punto original hasta la interfase esferoide-colágeno I y si esta distancia era ≤30 µm, la pista se clasificó como borde, de lo contrario, la pista se clasificó como núcleo. Se exportaron el número de pista, las coordenadas del punto y el número de cuadro. El cálculo del índice de distancia se realizó utilizando un código Matlab personalizado (disponible a pedido).

Las coordenadas de las trayectorias de las células individuales se obtuvieron mediante el seguimiento de partículas con el origen de cada esferoide en (0,0), y se transformaron del sistema de coordenadas polares cartesianas {x,y} a {r,ϕ}. Luego se calcularon los desplazamientos cuadráticos medios (MSD) en direcciones radiales y angulares, se promediaron sobre diferentes esferoides y repeticiones experimentales para diferentes condiciones. Luego, los datos de MSD se ajustaron a una ley de potencia, en ambas direcciones, a saber

y

donde \(({r}_{0},{\phi }_{0})\) corresponden al origen de cada trayectoria en el sistema de coordenadas polares, \({\Gamma }_{r,\phi }\ ) corresponden a las amplitudes de las leyes de potencia, y \({\alpha }_{r,\phi }\) son los exponentes, en dirección radial y angular, respectivamente. Los datos de MSD se ajustaron a estas leyes de potencia utilizando el algoritmo de Levenberg-Marquart, con el rango de ajustes en el intervalo [0, 3 h]. Tenga en cuenta que la motilidad de las células es subdifusiva para α < 1, difusiva para α = 1 y superdifusiva para α > 1.

En la dirección radial, dado que se encontró que el movimiento era súper difusivo, también calculamos el coeficiente de difusión efectivo dependiente del tiempo dado por56

Resultando en

Es importante tener en cuenta que, para el movimiento que no es difusivo, dependiente del tiempo \({{{{{\rm{D}}}}}}}_{{{{{\rm{eff}}} }}}}\left(t\right)\) es la única forma de estimar un coeficiente de difusión con las unidades correctas y comparar diferentes conjuntos de datos de manera consistente, siempre que se elijan los mismos puntos de tiempo para la comparación.

Las células se sembraron en placas recubiertas con poli-L-lisina y se cultivaron hasta un 80% de confluencia. Las células se recolectaron en tampón de lisis RIPA enfriado con hielo (Teknova), complementado con inhibidores de proteasa (cóctel completo, Roche) e inhibidores de fosfatasa (cóctel Halt, Sigma-Aldrich). La SDS-PAGE se realizó con 20 µg de proteína por muestra, se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Immobilon), se bloqueó con BSA al 5%/TBST durante 3 h a temperatura ambiente y se incubó con anti-β-actina (Santa Cruz Biotechnology, sc- 47778; 1 a 500), anticortactina (Abcam, ab33333; 1 a 1000), anti-E-cadherina (BD Transduction Laboratories, 610181; 1 a 1000), anti-FAK (Santa Cruz Biotechnology, sc-271126, 1 a 100), anti-fosfo-FAK (Tyr397) (Invitrogen, 44625 G, 1 a 100) anti-N-cadherina (BD Transduction Laboratories, 610920; 1 a 500) y anti-Tks5 (Millipore, MABT336; 1 a 500 ) anticuerpos diluidos en BSA al 5 %/TBST durante la noche a 4 °C. Luego, las membranas se incubaron con anticuerpos IgG anti-ratón o anti-conejo conjugados con HRP (Tecnologías de señalización celular; 1 a 5000) diluidos en leche descremada al 5%/TBST durante 1 h a temperatura ambiente y las proteínas se visualizaron utilizando reactivos de detección de quimioluminiscencia. (WesternBright, Advansta) y escáner de transferencia (C-DiGit, LI-COR).

Para formar tumores en ratones, se suspendieron 200 000 células en 100 μl de colágeno I al 20 % en PBS y se inyectaron ortotópicamente en la almohadilla de grasa mamaria de ratones hembra de 7 semanas de edad. Para la inoculación con mezclas de células 4T1 o MDA-MB-231, la proporción de células fue 1:1 y 1:300 para 4T1:67NR. Cuando el diámetro del tumor alcanzó 8-12 mm, 14-20 días en ratones Balb/cJ para 4T1 y 67NR, 8-10 semanas en ratones SCID para MDA-MB-231, los animales se sacrificaron y se recolectaron los tumores y los pulmones. Para el ensayo clonogénico de pulmón (https://doi.org/10.5281/zenodo.6639302), los pulmones se picaron, se digirieron en un cóctel de colagenasa tipo IV/elastasa (Worthington Biochemical) y se filtraron a través de una malla de 70 μm. Luego, la suspensión celular de cada pulmón se dividió en dos placas de cultivo de tejidos. Una placa se incubó con una combinación de 6-tioguanina (Cayman Chemicals) y puromicina, para el crecimiento de células Tks5-CTL y Tks5-KD. La otra placa se incubó con una combinación de 6-tioguanina, puromicina y geneticina para el crecimiento de células 4T1 Tks5-KD únicamente, o con una combinación de 0,5 µg/ml de puromicina y 500 µg/ml de geneticina (Invitrogen) para el crecimiento de MDA- MB-231 D2-KD. Después de 14 días a 37 °C y 5 % de CO2, las colonias se fijaron en metanol, se tiñeron con azul de metileno al 0,03 % (p/v) (Sigma-Aldrich) y se contaron (4T1 y 67NR), o se contaron usando marcaje fluorescente (D2 -KD).

Para realizar transferencias Western en tumores, los tumores Tks5-KD se recolectaron, trituraron y digirieron en una solución de colagenasa tipo III (Worthington Biochemical) recién preparada en HBSS, se filtraron a través de una malla de 70 μm y se cultivaron durante 7 días en el medio suplementado con 6- tioguanina y geneticina. Las células se lisaron como se describe anteriormente.

Para obtener imágenes de las secciones del tumor, los tumores se fijaron en PFA al 4 %, 4 °C durante la noche, se lavaron con PBS helado durante 1 h, se transfirieron a una solución de sacarosa al 30 % y se incubaron durante la noche a 4 °C, se incluyeron, congelaron en OCT y se cortaron a 6 µm de espesor. Para aumentar la señal de 67NR-GFP, los tumores mixtos 4T1-67NR se marcaron con anticuerpo primario anti-GFP (ab13970, 1 a 100) y cabra anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor® 488, ab150169), y los núcleos se tiñeron con DAPI .

Se utilizó el software RStudio para realizar todos los análisis estadísticos. Se analizó la distribución de cada conjunto de datos y se realizó la prueba de Shapiro-Wilk para comprobar la normalidad. Para conjuntos de datos normalmente distribuidos, se realizó una prueba F para comparar las varianzas de dos conjuntos de datos. Según los resultados de la prueba F, se realizó una prueba t de dos muestras de Welch o una prueba t de dos muestras para comparar las medias de los dos conjuntos de datos. Para conjuntos de datos que no se distribuyen normalmente, se realizó una prueba de suma de rangos de Wilcoxon para comparar los dos conjuntos de datos. A menos que se indique lo contrario, todas las pruebas se realizaron utilizando criterios no apareados y de dos colas. Todos los datos se representan como gráficos de líneas o diagramas de caja con mediana (línea), percentiles 25/75 (cajas) y máximo/mínimo (bigotes). La significación estadística se definió como *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Puede encontrar información adicional sobre las métricas y estadísticas en el archivo de datos de origen. Todos los datos están disponibles bajo petición.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y su información complementaria como Datos complementarios 1. Para las leyendas de los datos de origen y las películas, consulte la Descripción de materiales complementarios adicionales. El plásmido pmScarlet-H-C1 fue un regalo de Dorus Gadella (plásmido Addgene n.° 85043), mientras que pEGFP-puro fue un regalo de Michael McVoy (plásmido Addgene n.° 45561). Las transferencias Western sin recortar están disponibles en las Figs. complementarias. S13–S27.

Todo el código para el procesamiento y análisis de datos asociado con el envío actual está disponible en https://github.com/tuzellab/cooperative_invasion y (https://doi.org/10.5281/zenodo.6639302).

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Nos gustaría agradecer al núcleo de citometría de flujo de la Escuela de Medicina Lewis Katz por su ayuda con la clasificación de células, y a los miembros de Temple Bioengineering y Fox Chase Cancer Center Biology por sus valiosos debates. El financiamiento fue proporcionado por NIH R00 CA172360, R01 CA230777 (BG) y R01 GM121679 (ET); Subvención para becarios de investigación de la Sociedad Estadounidense del Cáncer 134415-RSG-20-034-01-CSM (BG) y Conquer Cancer Now/Premio al joven investigador (BG).

luisiana perrin

Dirección actual: Institut Curie, UMR144, París, Francia

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Temple, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

Louisiane Perrin, Elizaveta Belova, Battuya Bayarmagnai, Erkan Tüzel y Bojana Gligorijevic

Programa de señalización y epigenética del cáncer, Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

Bojana Gligorijevic

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Conceptualización: LP, BG, Adquisición de datos: LP, EB, BB, BG, Análisis: LP, EB, BG, ET, Supervisión: BG, Escritura: LP, EB, BB, ET, BG

Correspondencia a Bojana Gligorijevic.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Jing Yang, Feng Chiao Tsai y Díaz Begoña por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Ruby Huang y Eve Rogers. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Perrin, L., Belova, E., Bayarmagnai, B. et al. Los invadopodios permiten la invasión cooperativa y la metástasis de las células de cáncer de mama. Commun Biol 5, 758 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03642-z

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Recibido: 16 junio 2021

Aceptado: 28 junio 2022

Publicado: 01 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03642-z

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