Mejora de una terapéutica bacteriana viva sintética para la fenilcetonuria con biosensor

Nature Communications volumen 12, Número de artículo: 6215 (2021) Citar este artículo

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En los pacientes con fenilcetonuria (PKU), un defecto genético en la enzima fenilalanina hidroxilasa (PAH) provoca un aumento de la fenilalanina sistémica (Phe), lo que puede provocar un deterioro neurológico grave. Como tratamiento para la PKU, la cepa SYNB1618 de Escherichia coli Nissle (EcN) se desarrolló bajo la plataforma Synthetic Biotic™ de Synlogic para degradar la Phe desde el interior del tracto gastrointestinal (GI). Esta cepa diseñada en etapa clínica expresa la enzima metabolizadora de Phe fenilalanina amoníaco liasa (PAL), que cataliza la desaminación de Phe al producto no tóxico trans-cinamato (TCA). En el presente trabajo, generamos una cepa de PKU basada en EcN más potente a través de la optimización de la actividad PAL de células completas, utilizando un cribado de alto rendimiento basado en biosensores de bibliotecas PAL mutantes. Una enzima candidata principal de esta selección se utiliza en la construcción de SYNB1934, una cepa integrada cromosómicamente que contiene las características adicionales de bioseguridad y metabolización de Phe que se encuentran en SYNB1618. Frente a frente, SYNB1934 demuestra un aumento aproximado del doble en la actividad PAL in vivo en comparación con SYNB1618.

La enfermedad metabólica fenilcetonuria (PKU) se caracteriza por la ausencia o alteración de la función de la enzima fenilalanina hidroxilasa (PAH). Los pacientes con PKU no pueden metabolizar el aminoácido fenilalanina (Phe), lo que provoca su acumulación sistémica. Los niveles elevados de Phe pueden provocar complicaciones neurológicas graves y discapacidad si no se tratan. Afortunadamente, la PKU ha sido diagnosticada a través de pruebas de detección en recién nacidos durante más de 50 años, y si la enfermedad se detecta y trata dentro de las primeras semanas de vida, las discapacidades graves pueden mitigarse1.

Dado que la Phe es un aminoácido esencial, su ingesta en los pacientes puede controlarse mediante la restricción dietética de proteínas; sin embargo, muchos pacientes no logran un cumplimiento duradero debido a la naturaleza estricta de la dieta. De hecho, la interrupción de la dieta PKU en la edad adulta se ha relacionado con una marcada reducción de la función ejecutiva y el trastorno depresivo mayor2,3. Además de controlar la ingesta de Phe mediante el manejo dietético, existen dos opciones de tratamiento farmacológico aprobadas. Una de estas opciones, el diclorhidrato de sapropterina (KUVAN, BioMarin Pharmaceutical), es un activador de PAH para pacientes con PKU que responde a la tetrahidrobiopterina (BH4). La sapropterina es un análogo de BH4 que proporciona un cofactor adicional y/o promueve el plegamiento productivo de la enzima PAH mutante. Sin embargo, debido a su mecanismo, la sapropterina solo es eficaz en el subgrupo de pacientes con PKU que tienen actividad PAH residual, que se estima que es aproximadamente un tercio de la población con PKU4,5. Incluso en pacientes que responden a la BH4, la sapropterina rara vez se utiliza como terapia única y debe combinarse con un tratamiento dietético paralelo6. La otra opción de tratamiento, Pegvaliase (Palynziq, BioMarin Pharmaceutical), consiste en una enzima degradante de Phe pegilada inyectada sistémicamente, fenilalanina amoníaco liasa (PAL). Sin embargo, esta terapia se ha asociado con informes de reacciones adversas inmunomediadas graves y anafilaxia7,8. Sigue existiendo la necesidad de opciones de tratamiento terapéutico seguras administradas por vía oral para pacientes con PKU que aborden las necesidades de toda la población de pacientes, independientemente de su edad o antecedentes genéticos.

Recientemente ha habido un interés significativo en la aplicación de la biología sintética al diseño y la ingeniería de organismos probióticos que pueden ejercer funciones terapéuticas desde el interior del tracto gastrointestinal (GI)9. Anteriormente informamos sobre la construcción y caracterización del producto bioterapéutico vivo (LBP) SYNB1618 para el tratamiento de PKU10. Esta cepa genéticamente modificada de Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) expresa enzimas, incluidas PAL (StlA) de Photorhabdus luminescens y L-aminoácido desaminasa (LAAD) de Proteus mirabilis11, destinadas a degradar la Phe dietética y enterrorecirculante en metabolitos no tóxicos dentro de la Tracto GI (ácido cinámico12,13 y fenilpiruvato14, respectivamente). Se informó que SYNB1618 redujo significativamente la Phe plasmática en ratones Pahenu2/enu2 (un modelo de PKU en ratones), así como también previno significativamente un pico en la Phe plasmática en primates no humanos (NHP) sanos a los que se les administró un bolo de proteína10. SYNB1618 se evaluó en un primer estudio aleatorizado, controlado con placebo en humanos en voluntarios sanos y pacientes con PKU, donde se encontró que la cepa era segura y bien tolerada, con aumentos que respondían a la dosis en metabolitos de Phe específicos de SYNB1618 en plasma y orina15.

A medida que avance el entusiasmo por los LBP diseñados, también lo hará el interés en las metodologías empleadas para mejorar su rendimiento. Para organismos como E. coli, existe una multitud de partes modulares para la construcción de circuitos genéticos transcripcionales que permiten la expresión sintonizable de la función efectora modificada9. Mejorar la expresión de genes heterólogos en cepas modificadas es un enfoque directo para optimizar la actividad y es el primer cuello de botella potencial que se aborda cuando se busca maximizar la función de la cepa. Mejorar la función de la cepa más allá de la expresión génica se basa en la aplicación de otras tecnologías existentes o en evolución.

Los biosensores han surgido como un enfoque prometedor para aliviar la limitación del rendimiento en la ingeniería metabólica y de proteínas16. Al controlar una señal indicadora, como el crecimiento o la fluorescencia, los biosensores permiten el enriquecimiento rápido de tamaños de biblioteca que antes no eran accesibles. Las tasas de detección pueden llegar a 107 por hora cuando se utiliza la fluorescencia como indicador y las células se fenotizan en un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS)17. Hasta la fecha, los esfuerzos de detección de biosensores se han centrado en implementar factores de transcripción alostéricos (aTF) que se encuentran en la naturaleza para mejorar la producción de metabolitos tan diversos como el antioxidante flavonoide naringenina hasta el raro azúcar no tóxico psicose18,19,20,21,22,23 . Aunque los aTF se han diseñado con éxito para responder a metabolitos novedosos24,25,26, hasta donde sabemos, no hay relatos publicados que describan el uso de aTF modificados para mejorar las cepas comerciales o terapéuticas.

En este trabajo, primero diseñamos un aTF para detectar y responder a la presencia de trans-cinamato (TCA), el producto del catabolismo de Phe por PAL. Usando este biosensor como un medio de detección y selección, describimos la evolución dirigida de StlA, el PAL en nuestro LBP, para mejorar la actividad de células completas. Es importante destacar que la detección y la selección podrían realizarse en EcN para que la mejora de la actividad PAL se evaluara en el contexto de una cepa terapéuticamente relevante. Se utilizó una variante candidata de PAL para construir una cepa terapéutica de PKU de segunda generación, SYNB1934, que demostró superar a SYNB1618 in vitro e in vivo.

PAL es una enzima relativamente sencilla que no depende del oxígeno, los equivalentes redox o los cofactores27. Sin embargo, en un contexto de células completas, la actividad de PAL puede verse influenciada por una multitud de factores fisiológicos o ambientales, incluida la actividad metabólica bacteriana (para impulsar la entrada de Phe o la salida de TCA de las células), el pH externo o la inhibición del producto final. El trabajo preliminar buscó determinar si la actividad de la tensión estaba limitada por la expresión de PAL, ya que esto ofrecería una ruta simple para la optimización de la tensión. Sin embargo, la producción de TCA se estancó con el aumento de la expresión de PAL (Figura 1 complementaria). Por lo tanto, centramos nuestros esfuerzos en optimizar el rendimiento en lugar de la expresión de la propia enzima PAL en formato de células completas.

Para permitir la detección de bibliotecas PAL de alta complejidad para mejorar la degradación de Phe (producción de TCA), se diseñó un biosensor sensible a TCA específico utilizando la plataforma de ingeniería de sensores patentada de Zymergen. En ausencia de TCA, el aTF diseñado reprime la expresión de un gen (gfp etiquetado en la Fig. 1a) que codifica la proteína indicadora fluorescente (proteína fluorescente verde, GFP); cuando se introduce TCA en el sistema, se alivia la represión y se expresa gfp (Fig. 1a). Este sistema de sensor se transformó como un plásmido de copia alta en un fondo EcN de tipo salvaje y demostró una lectura de señal GFP ordenada por rango para TCA producida por una escalera de variantes PAL de los primeros esfuerzos de ingeniería, expresadas a partir de construcciones de copia baja (Fig. .1b). Con fines de demostración, cada una de las cepas de la Fig. 1b se cultivó por separado en tubos de ensayo y se analizó la señal de GFP por célula en un citómetro de flujo tras la saturación. Este enfoque de escala de cepas no tiene en cuenta ninguna diafonía de cepas que pueda observarse en una biblioteca agrupada (p. ej., productores de TCA bajos que responden a TCA en los medios a granel producidos por fenotipos de producción mejorados). Se logró un enriquecimiento significativo de una biblioteca agrupada de alta complejidad, que se describe con más detalle a continuación, mediante un flujo de trabajo basado en microfluidos (Fig. 1c; simulacro frente al 1% superior p < 0,0001, simulacro frente al 1% superior-1 superior % p < 0,0001, y enriquecimiento adicional del 1% superior al 1% superior - 1% superior p < 0,0001, prueba de análisis de varianza (ANOVA) de Welch con prueba de comparaciones múltiples T3 de Dunnett).

a Representación esquemática de la expresión de reportero regulada por biosensor. En ausencia de TCA, el factor de transcripción alostérico (aTF, sensor marcado en la figura) se une al sitio del operador de ADN y evita la expresión del gen informador gfp que codifica una proteína fluorescente verde (GFP). La actividad de PAL convierte la l-Phe en TCA; El TCA se une al sensor aTF, provocando un cambio conformacional para aliviar la unión al ADN (represión) y permitiendo la expresión del gen informador. Símbolos y abreviaturas: fenilalanina (l-Phe, círculos rellenos de amarillo), ácido transcinámico (TCA, círculos vacíos de color naranja), PAL (fenilalanina amoniaco liasa). b Arriba: actividad de células completas (consulte Métodos, basado en placas) de seis variantes de StlA PAL, normalizadas a la actividad de StlA de tipo salvaje (los valores de tipo salvaje, FOWT y de tipo salvaje se pueden encontrar en los datos de origen) . n = 2 réplicas biológicas, se muestran puntos de datos individuales. Abajo: histogramas GFP por celda de variantes del panel superior después del crecimiento hasta la saturación con expresión simultánea de variantes stlA (codificación genética para StlA), respuesta del sensor y expresión gfp (codificación genética para GFP). Los colores son consistentes entre los gráficos. n = 1 cultivo representativo por cepa con 50.000 células analizadas. c Demostración de enriquecimiento de la biblioteca PAL diseñada. Diagramas de caja que muestran la actividad de FOWT de diferentes poblaciones clasificadas, con puntos de datos clonales adjuntos. Las cajas se extienden desde el primer al tercer cuartil, con una línea central que indica la mediana. Los bigotes superior e inferior se extienden hasta el punto máximo y mínimo, respectivamente, dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico de los límites de la caja. Los puntos de datos fuera de los bigotes se consideran valores atípicos. Descripciones de clasificación/control: tipo salvaje, EcN que alberga StlA de tipo salvaje, n = 12 réplicas biológicas normalizadas al promedio de los 12 valores de producción de tipo salvaje; simulacro, biblioteca clasificada en función del tamaño de celda y exclusión de doblete sin selección basada en GFP, n = 90 colonias independientes del grupo clasificado; 1 % superior, selección del 1 % superior de células más brillantes también seleccionadas según el tamaño de celda y la exclusión de dobletes, n = 90 colonias independientes del grupo clasificado; simulacro-simulacro, población simulada retransformada en fondo EcN fresco con sensor y clasificada de forma simulada por segunda vez sin selección de GFP, n = 90 colonias independientes del grupo clasificado; 1% superior-1% superior, población del 1% superior retransformada en fondo EcN fresco con sensor y clasificada por su 1% superior de células más brillantes, n = 90 colonias independientes del grupo clasificado. Los valores de P se calcularon usando la prueba ANOVA de Welch con la prueba de comparaciones múltiples T3 de Dunnett.

La diafonía es un problema común en el despliegue de tecnologías de selección para aislar fenotipos de producción mejorados para metabolitos que se difunden o se transportan a través de la membrana celular, incluido el TCA. Al diluir los cultivos y reducir los plazos de cultivo para minimizar la acumulación de TCA en el medio a granel, Flachbart et al.18 pudieron aislar variantes de enzimas con actividad PAL mejorada de una biblioteca propensa a errores de 2,3 × 106 miembros utilizando un sistema de sensores basado en el activador nativo sensible a TCA HcaR de E. coli. Otro enfoque para minimizar la difusión de moléculas pequeñas es encapsular variantes individuales de manera microfluídica en aceite fluorado o en perlas de gel19,28,29 y luego clasificar las gotas30, pero esto tiene un costo para el rendimiento. Si bien la generación de gotas de agua en aceite puede alcanzar frecuencias de hasta 10 000 gotas por segundo30, las tecnologías de clasificación de gotas de agua en aceite generalmente alcanzan tasas de solo decenas a cientos de gotas por segundo19,30. Esto se puede aumentar a aproximadamente mil gotas por segundo encapsulando las gotas de agua en aceite en una segunda fase acuosa (es decir, gotas de agua en aceite en agua, también conocidas como emulsiones dobles) y clasificándolas en un FACS28 comercialmente disponible. , pero el proceso de doble emulsión es técnicamente desafiante y propenso a la inestabilidad y sedimentación durante la clasificación.

En el presente trabajo, combinamos la mitigación de la difusión de las incubaciones de gotas con el rendimiento y la facilidad de la clasificación de células en un FACS en un flujo de trabajo que hemos denominado pop 'n' sort (Fig. 2)31, que está habilitado por el genotipo- asociación fenotípica de nuestra tecnología de sensores. Dado que las variantes de PAL se expresaron dentro de la misma cepa EcN que albergaba el sistema sensor, la respuesta de GFP está vinculada a la propia célula productora en lugar de a la gota, como es el caso en los sistemas de cultivo conjunto de productores y células sensoras dedicadas19,29. Se lograron enriquecimientos significativos cuando se usó la metodología pop 'n' sort (Fig. 2b complementaria; simulacro vs 1% superior-1% superior p = 0.0007, prueba ANOVA de Welch con prueba de comparaciones múltiples T3 de Dunnett) versus cuando se clasificó directamente de saturado cultivo líquido (Fig. 2a complementaria; p = 0.1408).

Las células EcN que albergan el plásmido del sistema sensor de copia alta (expresión de aTF diseñada, con el gen gfp reprimido por aTF que codifica la proteína verde fluorescente GFP) y una biblioteca de plásmidos de expresión variante stlA inducible de copia baja se cultivaron juntas dentro de un grupo; diferentes células en este grupo contienen secuencias stlA únicas. Después de un paso de precultivo en un medio rico, las células se lavan y se resuspenden en un medio de glucosa mínima M9 adaptado para la detección de sensores, que simultáneamente induce la expresión de stlA y proporciona el sustrato Phe. En esta etapa, las células se diluyen a una DO600 que dará como resultado una carga de ~1 célula/gota. Estas células lavadas y diluidas en medio sirven como fase acuosa para la generación de gotitas en un aceite fluorado con tensioactivo fluorado. Debido a que la carga de células sigue una distribución de Poisson, algunas gotitas estarán vacías y algunas contendrán múltiples células/genotipos en el tiempo 0, como se muestra arriba. Las gotitas cargadas se incuban hasta la saturación, ~16 h, momento en el que hay muchas células por gotita, y estas células han producido TCA y una señal de GFP por célula que se correlaciona con esa producción de TCA. Dado que la señal de GFP está asociada con la propia célula, podemos romper las emulsiones utilizando técnicas estándar y luego clasificar las células directamente en un FACS para el fenotipo deseado. Consulte Métodos para obtener detalles sobre recetas, materiales y protocolos.

En los enriquecimientos pop 'n' sort descritos en el presente documento, las células se encapsularon microfluídicamente en gotitas de agua en aceite a ~1 célula/gotita. Las gotas se incubaron hasta que los cultivos encapsulados se saturaron, aproximadamente 16 h en nuestros medios y condiciones de crecimiento, momento en el que se rompieron las emulsiones (Métodos). La capa acuosa que contenía las células se separó del aceite y pudo clasificarse directamente en un FACS usando protocolos estándar. El enfoque de detección de ultra alto rendimiento descrito anteriormente nos permitió evaluar una biblioteca combinatoria de más de 1 millón de miembros de mutaciones diseñadas computacionalmente.

Se construyó un modelo de homología de StlA usando RosettaCM32 (ver Métodos) y se usó para identificar los residuos del sitio activo. Para mejorar la actividad de StlA, se seleccionaron posiciones alrededor del sitio activo para variar. Para compensar las inestabilidades introducidas por mutaciones en y alrededor del sitio activo, se realizaron análisis filogenéticos (matriz de puntuación específica de posición33; PSSM) y coevolutivos (GREMLIN34) para sugerir residuos favorables (ver Métodos). Como se muestra en la Fig. 3a, los análisis evolutivos de PSSM y GREMLIN introducen mutaciones estabilizadoras que están ampliamente dispersas en StlA.

Las posiciones de interés se destacan en un modelo de homología generado para StlA utilizando RosettaCM. Los residuos del sitio activo están resaltados en rojo. a Posiciones objetivo de mutagénesis combinatoria durante la construcción de bibliotecas. Cualquier posición mutada en las plantillas de la biblioteca (ver Métodos) se resalta en verde, y las mutaciones adicionales dirigidas durante la mutagénesis combinatoria se muestran en rosa. b Posiciones mutadas en top hits. Las posiciones mutadas en la variante PAL SYNB1934 final se resaltan en amarillo, y las mutadas en otros éxitos principales (indicadas con marcadores especiales en c, más detalles en el Suplemento) se muestran en azul. c Se generó un árbol filogenético calculando la distancia entre todas las secuencias utilizando la matriz de sustitución Blosum6257 y construyendo el árbol mediante la unión de vecinos en Biopython58,59. Los colores indican el nivel de actividad normalizado a tipo salvaje (FOWT). Marcadores: cuadrado = S92G_H133F_A433S_V470A, diamante = S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, x = A93C_H133F_T322W_Y437N, cuadrado de estrella = I28R_S92G_H133F_V470A, círculo grande = S92G_H133 F_R185E, hexagrama = S92G_F109A_H133M_T503E, tipo salvaje = reloj de arena; todas las demás variantes únicas se muestran como un pequeño círculo.

Las mutaciones diseñadas se introdujeron en StlA de tipo salvaje y tres variantes de StlA mejoradas (consulte la Fig. 3 complementaria y el texto circundante para conocer el origen de las plantillas) utilizando un enfoque basado en PCR como se describe en los Métodos. La biblioteca de plásmidos construida se transformó en EcN que contenía nuestro sistema sensor y se preparó para la clasificación de células utilizando la estrategia pop 'n' sort. Después de la incubación en gotitas, las células se clasificaron mediante FACS para recoger el 1% superior de células más brillantes. La población resultante exhibió un aumento en la producción mediana de TCA de una submuestra de 90 variantes clonales y carecía de la mayoría de las variantes de baja actividad. La segunda ronda de pop 'n' sort que aisló el 1 % superior del 1 % superior anterior (1 % superior-1 % superior de la Fig. 1c) enriqueció aún más la población a una mediana de >25 % de mejora sobre el tipo salvaje con aún menos falsos positivos. Los conjuntos del 1% superior y del 1% superior al 1% superior mostraron enriquecimientos significativos en comparación con sus controles clasificados de forma simulada (p < 0,0001, prueba ANOVA de Welch con prueba de comparaciones múltiples T3 de Dunnett).

Después del enriquecimiento, se seleccionaron ~1500 clones para la evaluación basada en placas de la actividad de células enteras como se describe en Métodos, y se secuenciaron las variantes mejoradas. Seis variantes de PAL diferentes fueron de particular interés en función de sus diversas secuencias (Fig. 3c) y niveles de actividad tanto en ensayos in vitro iniciales como en experimentos de modelo GI de simulación in vitro (IVS) (posiciones resaltadas en la Fig. 3b, secuencias y actividad en la Tabla complementaria 1). El árbol filogenético de la Fig. 3c muestra cómo estas variantes divergen del tipo salvaje con tres a cinco sustituciones. Las seis variantes comparten una mutación en la posición 133 de histidina a fenilalanina o metionina, lo que aumenta el empaquetamiento de la enzima cerca del sitio activo y se asocia con una mayor actividad; la histidina de la enzima de tipo salvaje podría potencialmente distorsionar su hélice asociada al interferir con el oxígeno del carbonilo de A129. Cinco de las seis variantes principales también contienen una mutación S92G, ubicada en la parte C-terminal de la hélice, que puede servir para aumentar la flexibilidad al interferir con los enlaces de hidrógeno del oxígeno del carbonilo. S92G está ubicado cerca del sitio activo y, por lo tanto, podría influir en la unión y liberación del sustrato y/o producto. Estas mutaciones se combinan con diversas sustituciones adicionales con respecto al tamaño y la carga, como lo indican sus distancias en el árbol (Fig. 3c). Se pueden encontrar más especulaciones sobre los impactos potenciales de las mutaciones adicionales en la Tabla complementaria 2.

Las células pueden encontrar una variedad de condiciones de pH a medida que transitan por el tracto GI, y se ha observado que la actividad de células enteras de EcN que expresa PAL de tipo salvaje depende en gran medida del pH ambiental (Fig. 4a). Por lo tanto, buscamos determinar si las células que expresan enzimas PAL evolucionadas mostraban un perfil de actividad similar al de PAL de tipo salvaje cuando se sometían a cambios en el pH. Todavía se observó una tendencia general de actividad general reducida a un pH más bajo para todas las variantes probadas (Fig. 4a-d complementaria), y la actividad mejoró a un pH más alcalino (Fig. 4d complementaria). A pesar de una reducción general en la actividad para todas las variantes a pH 5, la mayoría de las cepas aún mantuvieron una mejora con respecto al tipo salvaje, al menos en puntos de tiempo posteriores (Fig. 4b, Fig. 4e complementaria). La variante A93C_H133F_T322W_Y437N (cepa ID EP2495), sin embargo, no funcionó bien en esta condición, con un FOWT promedio <1 a las 4 h (Fig. 4b) y una reducción de la actividad aún más severa en puntos de tiempo anteriores (Fig. 4e complementaria), por lo que no procedimos con esta variante para realizar más pruebas.

a Producción de TCA de células enteras para EcN con StlA de tipo salvaje después de 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h o 4 h a pH 5, 6, 7 u 8. n = 3 réplicas biológicas con puntos de datos individuales mostrados . b Actividad de PAL de células completas después de 4 h a pH 5, 6, 7 u 8, normalizada a la actividad de StlA de tipo salvaje (doblar sobre tipo salvaje, FOWT). n = 3 réplicas biológicas ± sd c Actividad de PAL de células completas después de 4 h a pH 7, analizada sin tratamiento de pH (control) o después de incubación durante 1 h a pH 5 (tratado con pH), normalizada a la actividad de StlA de tipo salvaje (FOWT ). n = 3 réplicas biológicas ± sd Las etiquetas del eje X se refieren a ID de cepa, EcN con variantes PAL. EP2315: StlA de tipo salvaje, EP2516: S92G_H133F_A433S_V470A, EP2525: S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, EP2495: A93C_H133F_T322W_Y437N, EP2502: I28R_S92G_ H133F_V470A, EP2528: S92G_H133F_R185E, EP2526: S92G_F109A_H133M_T503E. Para puntos de tiempo adicionales y datos de producción de TCA no normalizados, consulte las Figuras complementarias 4 y 5.

Para evaluar la reanudación de la actividad de la cepa después del estrés ácido, las células se expusieron primero a un medio a pH 5 durante 1 h a 37 ° C, luego se analizó la actividad a pH neutro (Fig. 4c, Fig. 5 complementaria). En contraste con la actividad muy baja observada cuando se analizó a pH 5 (Fig. 4a complementaria), las células pudieron recuperarse de una exposición de 1 h a un medio de pH 5 y demostraron una actividad similar a las células de control (Fig. 4c, Fig. 5a complementaria). ). Todas las cepas mantuvieron la mejora sobre el control StlA de tipo salvaje después de la exposición a pH 5 (Fig. 4c, Fig. 5b complementaria).

Dos variantes, S92G_H133F_A433S_V470A y S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, se desempeñaron particularmente bien en ambas pruebas de pH y demostraron la mayor actividad a pH neutro. El lisado celular se preparó para EcN que albergaba cada una de estas dos variantes y el control PAL de tipo salvaje. Después de la normalización del contenido de proteína total, los lisados ​​de ambas variantes demostraron valores de Vmax y KM significativamente mayores en comparación con StlA de tipo salvaje (Vmax p = 0,0058 y KM p = 0,0023 para EP2315 frente a EP2516, Vmax p = 0,0135 y KM p = 0,0008 para EP2315 vs EP2525, basado en pruebas t de dos colas con una varianza desigual; Tabla 1), pero no hubo diferencia significativa entre las dos variantes con respecto a Vmax o KM.

Aunque no hubo una diferencia perceptible entre las dos variantes principales de PAL caracterizadas, se seleccionó la variante S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, en adelante denominada mPAL (por PAL mutante), para construir SYNB1934, una cepa bioterapéutica viva basada en EcN adecuada para la dosificación humana9. Se eligió esta variante en lugar de S92G_H133F_A433S_V470A porque no incorporaba una Phe adicional que, en última instancia, podría contribuir a la carga de Phe en la dieta en sujetos dosificados si las células se lisaban durante el tránsito. Además de las mutaciones S92G y H133M discutidas anteriormente, la variante incluye I167K, L432I y V470A. Por las razones discutidas con más detalle en la Tabla complementaria 2, sospechamos que L432I afecta la unión/liberación del sustrato, mientras que I167K y V470A probablemente desempeñan un papel en la estabilización de la enzima. Esta cepa contiene múltiples copias del gen que codifica mPAL integrado en el cromosoma y, con fines de biocontención, una mutación del gen dapA para generar auxotrofia para el componente esencial de la pared celular diaminopimelato (Fig. 5a). SYNB1934 también se diseñó para expresar los mismos componentes degradantes de Phe auxiliares de SYNB1618, a saber, el transportador de Phe de alta afinidad, PheP, y la enzima degradante de Phe alternativa LAAD10. Como es el caso de SYNB1618, todos los genes de resistencia a los antibióticos utilizados durante la ingeniería de SYNB1934 se eliminaron al finalizar la construcción de la cepa.

La actividad de la cepa PKU optimizada se compara con SYNB1618. a Representación esquemática de la bacteria SYNB1934 que muestra elementos de ingeniería clave, incluidos los genes que codifican mPAL, PheP, LAAD y la eliminación del gen dapA. b La producción de TCA de 2,5 × 109 células SYNB1618 frente a SYNB1934 liofilizadas resuspendidas se midió en una simulación in vitro del entorno intestinal. n = 3 triplicados biológicos independientes ± sd c y d A los sujetos con NHP se les dosificó por vía oral un péptido de 5 g y un bolo de 0,25 g de d5-Phe seguido de una dosificación con 1 × 1011 células SYNB1618 o SYNB1934 liofilizadas resuspendidas. Se muestran las áreas plasmáticas bajo la curva (AUC) para biomarcadores específicos de cepa TCA y d5-TCA. Para c, n = 18 sujetos NHP biológicamente independientes por grupo ± se Para cada comparación, los datos se analizaron mediante una prueba t no pareada de dos colas (p < 0,0001). Para la concentración urinaria de d5-HA normalizada a creatinina (d) n = 18 para sujetos tratados con SYNB1618 y 17 para sujetos tratados con SYNB1934 ± se (un NHP en el grupo tratado con SYNB1934 no pudo producir una muestra de orina durante el transcurso de la experimentación). Los datos se analizaron utilizando una prueba t no pareada de dos colas con la corrección de Welch (p = 0,0184).

SYNB1934 se cultivó e indujo para la actividad de degradación de Phe en un sistema de fermentación completamente controlado a alta densidad celular seguido de lavado, concentración, reformulación y liofilización. Este proceso simula la producción de un producto farmacéutico destinado a la dosificación humana. El material resuspendido de SYNB1934 y SYNB1618 liofilizados demostró una alta viabilidad según lo medido por el ensayo de exclusión de tinte fluorescente (Tabla complementaria 3). En simulaciones GI in vitro, SYNB1934 resuspendido demostró un aumento significativo en la tasa de producción de TCA de aproximadamente el doble en comparación con SYNB1618 (Fig. 5b; ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey, p < 0,001).

Para comparar la actividad in vivo de SYNB1934 con SYNB1618, pasamos a los estudios de NHP. Anteriormente informamos que el TCA en plasma se puede usar como un biomarcador específico de cepa único para rastrear la actividad PAL de cepas modificadas; la administración de EcN de tipo salvaje no resultó en la detección de este metabolito10. Después de un bolo oral de péptidos (peptona) y Phe deuterada (d5-Phe), los animales que recibieron SYNB1934 demostraron un aumento significativo en la exposición plasmática tanto a TCA como a d5-TCA en comparación con los animales que recibieron SYNB1618 (5,4 ± 1,0 frente a 2,9 ± 0,9 mM*h, respectivamente, para TCA, y 8,7 ± 2,0 frente a 4,6 ± 2,0 mM*h, respectivamente, para d5-TCA, se, Fig. 5c). Además, el TCA producido por las cepas in vivo es convertido cuantitativamente por las enzimas hepáticas en ácido hipúrico (HA) y dirigido a la excreción urinaria10,35. A diferencia del TCA en plasma, el AH urinario es un metabolito común que se encuentra en la orina de los primates y produce niveles de fondo significativos10,35,36. Sin embargo, el uso de d5-Phe oral como marcador metabólico permitió el cálculo de la excreción urinaria de HA atribuible específicamente a las cepas modificadas. Esto se debe a que, aunque hay muchos compuestos aromáticos que pueden metabolizarse a HA y dirigirse a la excreción, Phe no es uno de ellos10 y, por lo tanto, la única ruta metabólica de d5-Phe oral a d5-HA urinario es a través de d5-TCA. intermedio producido por PAL. A las 6 h posteriores a la dosificación, la concentración urinaria de d5-HA en animales que recibieron SYNB1934 fue más del doble que la de los animales que recibieron SYNB1618 (534,4 ± 107,0 frente a 249,1 ± 25,1 µg d5-HA/mg creatinina, se; Fig. .5d).

La PKU generalmente se maneja mediante la restricción dietética, que es una carga significativa para los pacientes. En muchos casos, un mal manejo de la dieta puede conducir a una baja calidad de vida. Los medicamentos Engineered Synthetic Biotic™ ofrecen el potencial de terapias seguras, tolerables, reversibles y administradas por vía oral para una variedad de afecciones metabólicas, incluida la PKU. EcN fue seleccionado como el chasis bacteriano ideal para el desarrollo de cepas Synthetic Biotic™. Descubierto en 1917, se ha utilizado en poblaciones humanas para una variedad de afecciones gastrointestinales, incluida la enfermedad inflamatoria intestinal y el síndrome del intestino irritable37,38. También se ha informado que la EcN interactúa con el epitelio intestinal para estimular las actividades antiinflamatorias y mejorar y mantener la función de barrera39. Es importante destacar que EcN no exhibe colonización a largo plazo en humanos sanos después de la administración oral40. La limitación del tiempo de residencia bacteriano y la replicación in vivo son atributos que permiten propiedades farmacológicas predecibles y reproducibles análogas a las terapias tradicionales de moléculas grandes y pequeñas9. La inclusión de auxotrofias en las cepas modificadas actúa como protección para garantizar resultados predecibles y limitar el crecimiento en el medio ambiente después de la excreción.

Este trabajo se centró en la aplicación de un biosensor aTF diseñado para mejorar la enzima PAL degradante de Phe para una cepa de tratamiento clínico de PKU, seguido del desarrollo y las pruebas preclínicas de un bioterapéutico vivo mejorado, SYNB1934. La lectura de fluorescencia controlada por biosensor permite a los investigadores fenotipar millones de genotipos en un solo día16. Sin embargo, la diafonía entre cepas de alta y baja producción históricamente ha presentado dificultades para lograr enriquecimientos efectivos para mejorar la producción18. Aquí, presentamos un método técnicamente simple, pop 'n' sort, para mitigar la difusión usando emulsiones de agua en aceite para los pasos de incubación, mientras clasificamos las células individuales en lugar de las gotas completas por FACS. Usando la metodología pop 'n' sort y nuestro biosensor diseñado, examinamos una biblioteca de más de 1 millón de miembros para mejorar la actividad PAL de células enteras e identificamos variantes con actividad mejorada. El mPAL que se usó en la cepa terapéutica mejorada contenía cinco mutaciones relativas a la enzima de tipo salvaje, tres de las cuales están dirigidas cerca del sitio activo y esperamos que desempeñen un papel en la unión/liberación del sustrato y dos de las cuales probablemente tener un efecto estabilizador.

En experimentos de lisado celular in vitro, mPAL mostró un aumento significativo de Vmax y KM. Para imitar la expresión y la actividad en el LBP final lo más cerca posible, las etiquetas de proteínas no se incluyeron en la construcción de bibliotecas de enzimas. Aunque el análisis cinético del lisado celular no permite desacoplar kcat de la concentración de enzima en los valores de Vmax informados (consulte la Tabla 1), la normalización del contenido de proteína total es más representativa de cómo sería una comparación directa de cepas terapéuticas. ser realizado. Es de destacar que una KM más alta es consistente con una hipótesis a lo largo del proyecto de que una KM baja (mayor afinidad de unión del sustrato a una enzima) puede correlacionarse con una inhibición más severa por parte del producto TCA, que es estructuralmente muy similar al sustrato Phe. Aunque la caracterización de la inhibición en StlA de tipo salvaje y mPAL no se llevó a cabo en este trabajo, la inhibición por retroalimentación por parte de TCA es un rasgo común en muchos otros PAL caracterizados cinéticamente41,42,43,44 y se supone que StlA se basa en el aumento de actividad observado. en lisado celular en comparación con células completas (Fig. 1 complementaria).

Indudablemente, las cepas que transitan por el tracto GI humano encontrarán exposición a pH variables. El efecto que esto puede tener sobre la actividad de la tensión es un parámetro que se modeló mecánicamente recientemente para SYNB161845, y el trabajo futuro tendrá como objetivo realizar un modelado similar para SYNB1934. Todas las variantes de PAL identificadas en este trabajo mostraron patrones muy similares de actividad de células completas en respuesta a cambios en el pH ambiental, aunque la mayoría de las variantes mejoradas aún demostraron una mayor actividad por encima de PAL de tipo salvaje en las mismas condiciones. En general, se informa que las enzimas PAL tienen un pH óptimo en el rango básico43,46,47,48, pero supusimos que E. coli se recuperaría y mantendría su pH citosólico casi neutral, independientemente del rango de pH ambiental probado durante estos estudios49. Sin embargo, se esperaría una mayor permeabilidad de la membrana y la acumulación citosólica de ácidos orgánicos como el TCA a medida que disminuye el pH, lo que podría resultar en una mayor inhibición por retroalimentación de PAL. El trabajo futuro tendrá como objetivo dilucidar la causa de la reducción de la actividad PAL de células enteras observada a pH bajo, lo que puede garantizar el desarrollo de una aplicación de sensor compatible con la detección de rendimiento ultraalto en condiciones ácidas. La incapacidad del cribado realizado en este trabajo, realizado a pH neutro, para identificar variantes con una tolerancia al pH muy mejorada está en consonancia con lo que se suele denominar la primera ley de la evolución dirigida: "obtienes lo que buscas"50. Las pantallas se pueden adaptar en consecuencia para enriquecer las características de interés, como la actividad a diferentes pH, temperatura, fuerza osmótica, etc. Dicho esto, hubo algunas diferencias fenotípicas sutiles en la respuesta de las cepas variantes de PAL principales a los cambios de pH. Se observaron variantes que tenían una actividad más drásticamente reducida que la enzima de tipo salvaje a pH bajo, o que mostraban una mayor tasa de cambio en la actividad sobre el tipo salvaje a medida que aumentaba el pH. Otras variantes mostraron la misma mejora en la actividad sobre la enzima de tipo salvaje independientemente del pH ambiental. Estos resultados subrayan la diversidad contenida dentro de la biblioteca de mutantes de más de 1 millón de miembros agrupada, que, cuando se acopla a la pantalla/sensor apropiado, se puede volver a implementar rápidamente para la selección de propiedades enzimáticas deseables alternativas.

En un ensayo clínico de fase 1/2a, se demostró que SYNB1618 consume Phe y la convierte en los metabolitos no tóxicos esperados de una manera que responde a la dosis en el intestino humano de voluntarios sanos y pacientes con PKU15. En este estudio, SYNB1618 no se asoció con toxicidad sistémica, y todos los sujetos eliminaron las bacterias a los pocos días de la última dosis. Aunque no tiene potencia para detectar un cambio en la Phe plasmática debido al pequeño tamaño de la cohorte de pacientes con PKU, los resultados respaldaron el estudio adicional de SYNB1618 en el ensayo clínico de fase 2 compuesto por una cohorte más grande de pacientes con PKU (SynPheny-1; NCT04534842). Paralelamente, SYNB1934 se construyó y probó de manera preclínica, donde demostramos que supera a SYNB1618 in vitro e in vivo. Recientemente se inició un estudio de fase 1 de SYNB1934 (NCT04984525). En relación con SYNB1618, SYNB1934 puede ofrecer una reducción mejorada de la Phe plasmática, el potencial de una dosificación más baja u otros beneficios terapéuticos.

Para la detección de biosensores y la caracterización de la variante PAL, el gen que codifica StlA de Photorhabdus luminescens11 y las variantes de StlA se expresaron a partir de plásmidos inducibles por anhidrotetraciclina (aTc) que contenían orígenes de replicación de copia baja (pSC101). Estos plásmidos codificaron un TetR autorregulado y un casete de resistencia a la espectinomicina constitutiva; Se proporcionaron 100 µg/mL de espectinomicina en todos los pasos de crecimiento para el mantenimiento del plásmido StlA. Los enfoques de creación y diseño de bibliotecas de variantes se describen a continuación. El sistema sensor (biosensor de TCA diseñado y expresión de gfp regulada por biosensor) estaba contenido en un solo plásmido de alto número de copias con un marcador constitutivo de resistencia a la ampicilina; Se proporcionaron 100 µg/mL de carbenicilina en todos los pasos de crecimiento para el mantenimiento del plásmido sensor.

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) se adquirió de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ Braunschweig, E. coli DSM 6601). Se construyeron cepas candidatas clínicas que degradan Phe mediante la inserción de genes en el cromosoma EcN. La construcción de SYNB1618 se ha descrito anteriormente10. Los loci intergénicos, malEK, araBC, yicS/nepI, agaI/rsmI, exo/cea y rhtBC se identificaron todos como sitios de inserción adecuados. Estas regiones intergénicas consisten en promotores divergentes o marcos de lectura abiertos convergentes separados por una longitud significativa de ADN, de modo que no se esperaría que ninguna secuencia insertada condujera a efectos polares en genes o promotores vecinos. Las inserciones cromosómicas en el genoma EcN se realizaron utilizando el enfoque de recombinación lambda Red bien caracterizado51. Para cada inserción, (1) se construyó un plásmido basado en pKD3 o pKD4 que contenía 1000 pb de homología genómica 5' y 3' EcN para la recombinación, seguido de (2) inserción del gen/promotor de interés en el plásmido mediante la isoterma ensamblaje (HiFI DNA Assembly Master Mix, NEB), (3) amplificación del fragmento de inserción del plásmido por PCR (incluidas las regiones de homología EcN y un sitio de reconocimiento de flipasa (frt) flanqueado por casete de resistencia a cloranfenicol o kanamicina para la eliminación posterior del casete de antibiótico, Q5 High-Fidelity Master Mix, NEB), (4) recombinación del fragmento de inserción mediante electroporación a través de pKD46 y posterior eliminación de pKD46, y (5) eliminación de casetes de resistencia a antibióticos a través de pCP20 y posterior eliminación de pCP20. Todas las secuencias de ADN para inserciones genómicas utilizadas en la construcción de SYNB1618 y SYNB1934 están disponibles previa solicitud.

Para la eliminación del gen dapA, se realizaron dos rondas de PCR utilizando cebadores anidados. Para la primera ronda de PCR, se utilizó pKD3 como ADN molde. Los cebadores se diseñaron para generar un fragmento de dsDNA que contenía homología adyacente al locus del gen dapA en el cromosoma EcN y un gen de resistencia al cloranfenicol flanqueado por sitios frt. Los cebadores usados ​​en la segunda ronda de PCR usaron el producto de PCR de la primera ronda como plantilla de ADN. El pKD46 que contenía EcN se transformó con el fragmento inactivado de dapA mediante electroporación. Las colonias se seleccionaron en agar LB que contenía cloranfenicol (30 μg/ml) y diaminopimelato (Sigma, D1377; 100 μg/ml).

Toda la electroporación se realizó en un Eppendorf Eporator (pulso de 1,8 kV, electrocubetas de 1 mm de longitud). Las células transformadas se seleccionaron como colonias en agar LB (Sigma, L2897) que contenía carbenicilina a 100 μg/ml de kanamicina a 50 μg/ml cuando correspondía.

La fenilalanina se obtuvo de VWR (número de catálogo 97062-556) o Sigma (número de catálogo P2126) y las sales M9 se adquirieron de Fisher (número de catálogo DF0485-17). Se analizó la biomasa activada para determinar la actividad de células enteras en M9 (6,8 g/L Na2HPO4 + 3 g/L KH2PO4 + 0,5 g/L NaCl + 1 g/L NH4Cl) + 0,5 % de glucosa + 40 mM de fenilalanina. Se utilizó una receta de glucosa M9 mínima adaptada con una concentración reducida de fenilalanina para las pruebas basadas en sensores: 1 % de glucosa + 13,6 g/L Na2HPO4 + 6 g/L KH2PO4 + 1 g/L NaCl + 2 g/L NH4Cl + 1 % LB Lennox + metales traza (0,0002% C6H8FeNO7, 1,8 mg/L ZnSO4·7 H2O, 1,8 mg/L CuSO4·5 H2O, 1,2 mg/L MnSO4·H2O, 1,8 mg/L CoCl2·6 H2O) + antibiótico para mantenimiento de plásmidos + 200 ng/ml de aTc para la expresión de la variante stlA + L-fenilalanina 10 mM como sustrato.

Se diseñó un biosensor aTF específico que responde a TCA utilizando la plataforma de desarrollo de sensores patentada de Zymergen. Se enriqueció a partir de una biblioteca de sensores diseñados mediante la selección de alta GFP por celda en presencia de TCA y baja GFP de fondo por celda en ausencia de TCA en un FACS. Los principales candidatos a biosensores se caracterizaron aún más por su especificidad para TCA sobre ligandos relacionados en el huésped de producción EcN, así como sus correlaciones con TCA producido usando variantes de StlA de niveles de actividad conocidos (Fig. 1b).

Se construyó un modelo de homología de StlA utilizando RosettaCM32. Las plantillas se identificaron utilizando HHblits y HHsearch52 buscando en las bases de datos Pfam y PDB70. RosettaScripts53 utilizó las 10 plantillas PDB con la puntuación más alta con la función de energía beta54 para construir un conjunto de estructuras de homología; Se generaron 200 señuelos y se seleccionó el de menor energía. El código utilizado en este análisis, junto con las instrucciones, se puede encontrar en el siguiente repositorio de GitHub: https://github.com/Zymergen/AdolfsenIsabella_NatComm.

Para diseñar bibliotecas para las enzimas objetivo, utilizamos tres enfoques: análisis filogenético, análisis coevolutivo y análisis estructural.

Para realizar el análisis filogenético, se generó un PSSM utilizando PSI-BLAST33 (normalmente utilizando la configuración predeterminada de valor e = 0,01 e iteraciones = 3) y se utilizó para evaluar sustituciones individuales de la secuencia de StlA de tipo salvaje. La matriz resultante contiene una puntuación para cada posible aminoácido en cada posición de la proteína, correspondiente a la frecuencia del aminoácido en esa posición en el conjunto de secuencias homólogas devueltas por PSI-BLAST. Estas sustituciones potenciales se compararon con la puntuación para el residuo de tipo salvaje en esa posición y, si las sustituciones de puntuación significativamente más altas (límite típico: puntuación z> 2) estaban disponibles del PSSM, el aminoácido en esa posición dada se seleccionó para verificación experimental.

Para ampliar el análisis e incluir acoplamientos de residuos, se realizó un análisis de coevolución para StlA utilizando GREMLIN34, y se analizaron y optimizaron todos los acoplamientos. Para las posiciones en las que el acoplamiento no era óptimo según el análisis, se seleccionó la sustitución de aminoácidos más óptima para probarla experimentalmente.

Por último, para apuntar al sitio activo, las posiciones cercanas al sitio activo se identificaron utilizando el modelo de homología (generación del modelo descrita en la sección anterior). Si esas posiciones se habían observado en el análisis filogenético (puntuación PSSM > 0), se incluían en la biblioteca para la validación experimental.

La biblioteca se creó en cuatro plantillas: StlA de tipo salvaje y tres variantes que habían demostrado un rendimiento mejorado en los primeros esfuerzos de ingeniería (H133M_I167K_V207I, S92G_H133F_Y437N y A93C_H133M_I167K, todas las cuales tuvieron una mejora del 20% al 40% en la actividad sobre StlA de tipo salvaje). Las plantillas variantes de StlA, cada una albergada dentro de un esqueleto de plásmido inducible por aTc de copia baja, se mezclaron en una proporción equimolar para proporcionar la plantilla de plásmido para un enfoque de construcción de biblioteca basado en oligo. Se diseñó un par de cebadores separados (datos complementarios) para introducir cada una de las mutaciones objetivo a través de una reacción Golden Gate de una pieza, utilizando PCR55 inversa para amplificar todo el plásmido en el sitio de mutación objetivo. Para las 130 mutaciones objetivo, se realizaron 130 PCR separadas (Q5 High-Fidelity Master Mix, NEB). Se ejecutó una submuestra de cada reacción en un gel de agarosa para permitir la cuantificación de la intensidad relativa de la banda, que se usó para normalizar y agrupar los 130 productos de la PCR. Los productos agrupados se digirieron con DpnI y se purificaron en gel, luego se circularizaron utilizando la mezcla NEB Golden Gate (BsaI-v2) a 37 °C durante 1 h, seguido de una inactivación térmica a 60 °C durante 5 min. La biblioteca circularizada agrupada de 130 mutaciones × 4 plantillas se transformó en células electrocompetentes NEB10β utilizando el protocolo de NEB. Los cultivos recuperados se transfirieron a LB con antibióticos para la selección de transformantes durante la noche, y una submuestra se sembró en placas de agar LB con antibióticos para confirmar la cobertura adecuada de la biblioteca. Este proceso se repitió dos veces más, generando bibliotecas combinatorias de una y dos combinaciones de mutaciones diseñadas después de un segundo ciclo, y una, dos y tres combinaciones de mutaciones diseñadas después de un tercero. Para los ciclos de clonación segundo y tercero, el plásmido de la biblioteca se purificó del cultivo de selección durante la noche y se usó como molde en la ronda posterior de mutagénesis por PCR. Después de tres ciclos de clonación, la biblioteca de más de 1 millón de miembros inducible por aTc de bajo número de copias se transformó en una cepa huésped de E. coli Nissle (EcN) de tipo salvaje que contenía el sistema sensor en un plásmido de alto número de copias.

Para reducir la diafonía durante la producción de TCA y la respuesta del sensor, las células se encapsularon en gotas de agua en aceite generadas por microfluidos. Las bibliotecas se inocularon en 10 ml de antibiótico LB+ (consulte "Plásmidos" más arriba) en tubos de ensayo de 25 mm de un volumen suficiente de almacenamiento de glicerol a -80 °C para mantener la complejidad de la biblioteca. Los cultivos se incubaron durante la noche ~16 h hasta la saturación, momento en el que se centrifugó 1 ml del cultivo a 17 800 × g durante 1 min y el sedimento se resuspendió en un volumen igual de medio de respuesta del sensor filtrado (consulte "Medios de ensayo" más arriba). La DO600 de las células lavadas se midió en un espectrofotómetro Genesys 20 con una dilución de 20x y las células se diluyeron a una DO600 de 0,03 en el mismo medio. Una OD600 de 0,03 da como resultado que se encapsule aproximadamente una célula por gota de 40 µm en promedio en el tiempo 0.

Se generaron gotas en aceite Sphere Fluidics (Pico-SurfTM 1, 2 % en NovecTM 7500, lote n.º 031117-1, diluido al 1 % de surfactante en NovecTM 7500 adicional) a una velocidad de ~3,4 kHz en un dispositivo de microfluidos de enfoque de flujo, fabricado internamente como chips PDMS en vidrio. Las gotas se recogieron en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se incubaron a 33 °C en una incubadora de pie sin girar durante ~16 h. Después de la incubación, las emulsiones se rompieron agregando un volumen suficiente de 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-1-octanol (Sigma), agitando en vórtex durante ~15 s y girando por pulsos ~1 s en una centrífuga ministerial VWR Galaxy para separar los capas orgánicas y acuosas. La capa acuosa contiene las células que se han liberado de las gotitas. La fase acuosa de las emulsiones fraccionadas se diluyó 100 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) filtrada antes de la clasificación celular.

Las células se clasificaron en un clasificador de células Bio-Rad S3E a una tasa de eventos objetivo de 1500 eventos/s con la muestra y las cámaras de recolección mantenidas a temperatura ambiente utilizando el software ProSortTM versión 1.6.0.12. Los eventos se recogieron en tubos de polipropileno con tapa a presión de 5 ml (Falcon) que contenían un volumen inicial de 0,5 ml de LB. Los eventos se seleccionaron utilizando tres métricas: una puerta elíptica SSC-Area vs FSC-Area para aislar celdas EcN de un tamaño similar, una puerta FSC-Height vs FSC-Area para excluir cualquier doblete y una GFP-Area (FITC-A) puerta para seleccionar celdas en función de una fuerte respuesta del sensor. Esta estrategia de selección se ejemplifica en la figura complementaria 6. El volumen clasificado se diluyó en suficiente LB Lennox + antibiótico para la recuperación durante la noche a 33 °C 220 rpm. Para evitar preocupaciones sobre la deriva genética de múltiples brotes, los plásmidos StlA de las poblaciones recuperadas se purificaron y transformaron en EcN fresco que contenía el plásmido sensor antes de realizar clasificaciones posteriores.

Se inocularon 150 µl de LB Lennox + antibiótico en placas estándar de 96 pocillos (número de catálogo VWR 82050-772) de colonias de E. coli Nissle que contenían plásmidos de expresión de la variante StlA y plásmido sensor. Estas placas de precultivo se incubaron durante la noche a 33 °C 750 rpm en una incubadora Incu-Mixer MP (Benchmark Scientific), cubiertas con película porosa VWR (número de catálogo VWR 60941-086).

Los precultivos de toda la noche se inocularon 1:100 en 1 ml de LB Lennox + antibiótico en placas de 96 pocillos profundos (número de catálogo de VWR 89047-264). Las placas se cubrieron con película porosa VWR y se incubaron en un Incu-Mixer a 33 °C 1500 rpm durante 2 h en fase exponencial. Después de 2 h, todos los pocillos se indujeron con 200 ng/mL de aTc (concentración final, número de catálogo de VWR 200002-828) y se colocaron nuevamente en el Incu-Mixer durante 4 h a 33 °C 1500 rpm, nuevamente cubiertos con una película porosa de VWR. Todos los pasos restantes se realizaron a 4 °C/en hielo. Después de 4 h, las placas se centrifugaron a 3214 × g durante 10 min. Se decantó el sobrenadante y se lavaron los sedimentos en 250 µl de PBS frío. La placa se centrifugó nuevamente a 3214 × g durante 10 min y se decantó. Los sedimentos se resuspendieron en 30 µl de PBS frío (~40 µl finales con sedimento celular). A esto, se añadieron 40 µl de glicerol frío al 50 %, lo que condujo a una preparación de OD600~25. Las preparaciones de células se transfirieron a placas de PCR de 96 pocillos enfriadas, se cubrieron con papel aluminio y se almacenaron a -80 °C hasta el ensayo.

Para el ensayo, se descongelaron alícuotas de placas de PCR de 96 pocillos de preparación de biomasa activada a 4 °C, y se dividieron en alícuotas de 4 µl de cada biomasa activada OD600 = 25 en una placa de PCR de 96 pocillos y se almacenaron en hielo hasta el inicio del ensayo. Para iniciar el ensayo, se agregaron 96 µL de tampón de ensayo precalentado (37 °C) (M9 0,5 % glucosa 40 mM fenilalanina) a los 4 µL de biomasa activada, se mezcló, se cubrió con papel aluminio y se colocó en el recipiente estático a 37 °C. incubadora. Después de 4 h, las células se sedimentaron por centrifugación a 3214 × g 4 °C durante 10 min. Después de la granulación, se cuantificó el TCA de los sobrenadantes en un lector de microplacas Synergy H1 a una absorbancia de 290 nm en microplacas UV-Star (número de catálogo Greiner 655801) después de la dilución en agua dentro del rango lineal del instrumento. El volumen final en la placa fue de 150 µL. Se usó una curva estándar para traducir las medidas de A290 a TCA (mM) usando ácido transcinámico adquirido de Sigma (número de catálogo C80857). Las concentraciones de TCA producidas a partir de variantes seleccionadas se confirmaron mediante cromatografía líquida de alta resolución. Para las normalizaciones de fold over wild-type (FOWT), los niveles de TCA variante se dividieron por los valores promedio de TCA de tipo salvaje del mismo ensayo.

Durante la caracterización adicional de las principales variantes de PAL, la biomasa activada se normalizó más meticulosamente a OD600 = 1 durante los ensayos de actividad. Se inocularon tubos de cultivo con 10 ml de LB Lennox + antibiótico 1:100 a partir de 3 ml de LB Lennox + antibiótico 33 °C 220 rpm precultivos durante la noche. Estos se incubaron durante 2 h a 33 °C 220 rpm, momento en el que se indujeron con 200 ng/mL de aTc y se colocaron nuevamente en la incubadora a 33 °C 220 rpm. Todos los pasos de preparación restantes se realizaron en hielo/a 4 °C. Después de 4 h de inducción, los cultivos se transfirieron a tubos cónicos de 15 mL (Falcon) y se centrifugaron a 3214 × g durante 10 min, se resuspendieron en 1 mL de PBS frío y se transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 mL. Luego se lavaron una vez más en 1 ml de PBS frío (17 800 × g 1 min en una microcentrífuga) y se resuspendieron por última vez en 300 µl de PBS. Las mediciones de OD600 se realizaron en cubetas y las células se normalizaron a OD600 = 50 en 300 µl de PBS frío. A los 300 µL OD600 = 50 en muestras de PBS, se agregaron 300 µL de glicerol frío al 50 % para obtener una OD600 final = 25. Se distribuyeron alícuotas en tubos PCR para cada cepa y se almacenaron a -80 °C hasta que se pudo realizar el ensayo de biomasa activada. .

Para los ensayos realizados a varios pH (Fig. 4b), la biomasa activada se descongeló a 4 °C y se diluyó a OD600 = 1 en M9 glucosa al 0,5 % 40 mM Phe titulado a pH 5, 6, 7 u 8 en 96 pocillos. Placas PCR. La placa se cubrió con papel aluminio y se incubó a 37 °C durante 4 h. Luego, las placas de PCR se centrifugaron a 3214 × g 4 °C durante 10 min y los sobrenadantes se cuantificaron mediante absorbancia a 290 nm como se describe en "Ensayo de biomasa activada basado en placas para la producción de TCA a partir de cepas" anterior.

Para los ensayos realizados después de la recuperación de un pH bajo (Fig. 4c), las alícuotas de biomasa activada se descongelaron y diluyeron a OD600 = 1 en glucosa M9 al 0,5 % a pH 5 (sin Phe) en placas de PCR de 96 pocillos. Las placas se incubaron a 37 °C durante 1 h sin agitación, se centrifugaron a 3214 × g 4 °C durante 10 min y se lavaron en PBS, y luego se analizó la actividad de biomasa activada a pH neutro como se describe en "Biomasa activada en placas". ensayo para la producción de TCA a partir de cepas" anterior. Para controlar la pérdida de células durante los pasos de lavado para eliminar el medio de pH 5, se agregó biomasa activada fresca a las placas de PCR de 96 pocillos, se lavó junto con las muestras incubadas a pH 5 y luego se analizó la actividad de la biomasa activada; estas muestras están etiquetadas como "control" en la Fig. 4c. Para las normalizaciones de FOWT, los niveles de TCA variante se dividieron por los valores promedio de TCA de tipo salvaje del mismo ensayo.

Se construyó una serie de cepas que expresan PAL en EcN, que incluía cepas (2) con una única inserción cromosómica de stlA en ubicaciones separadas, una cepa que contenía ambas copias cromosómicas del gen stlA en el mismo fondo, una cepa con una baja copia de stlA - que expresa plásmido (origen pSC101), y una cepa con un plásmido que expresa stlA con muchas copias (origen pUC). En cada una de estas cepas, se usaron la misma secuencia codificante de stlA, sitio de unión al ribosoma y promotor inducible por aTc, de modo que la única diferencia entre las cepas fue la ubicación de la inserción cromosómica y/o el número de copias del gen stlA. Para el crecimiento de cepas y la inducción de PAL, se inocularon matraces con deflectores de 50 ml con 10 ml de caldo LB Lennox que contenía antibióticos apropiados 1:100 a partir de cultivos durante la noche. Los matraces se cultivaron agitando a 37 °C 250 rpm en un agitador orbital Eppendorf durante 2 h para llevar los cultivos a la fase exponencial, momento en el que se añadió aTc a 200 ng/mL aTc (concentración final, número de catálogo VWR 200002-828). Se permitió que las células crecieran inducidas durante 4 h adicionales antes de la centrifugación durante 10 min a 5000 × g y la resuspensión de los sedimentos en un volumen igual de PBS enfriado con hielo.

Para medir la actividad PAL de células enteras, las cepas se resuspendieron a una DO600 de 0,1 en 1 ml de tampón de ensayo de Phe (M9 0,5 % de glucosa que contiene 40 mM de Phe) en tubos de microcentrífuga y se colocaron en un bloque térmico a 37 °C. Las muestras se retiraron cada 30 min durante 2 h y la concentración de TCA se determinó mediante la medición de OD290 como se describe anteriormente. Las tasas de producción de TCA se extrapolaron a partir de la concentración de TCA medida en el sobrenadante a lo largo del tiempo.

Para medir la actividad PAL de los lisados, se pasó un volumen de 6 ml de células resuspendidas a través de un homogeneizador Microfludizer® de bajo volumen Microfluidics™ LV1 a una presión de 18 000 psi. Cada cepa se pasó por el homogeneizador tres veces para asegurar la lisis completa. Los lisados ​​resultantes se centrifugaron a 12 000 × g durante 20 min para sedimentar el material insoluble. La concentración de proteína soluble total para cada lisado aclarado se determinó a través del ensayo BCA (Pierce, número de catálogo 23227). Las tasas de producción de TCA se determinaron de forma similar al método utilizado para las células completas descrito anteriormente, con la excepción de que se utilizaron 30 mg de proteína soluble para proporcionar PAL para el ensayo en lugar de la resuspensión de las células.

Los geles de electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) se ejecutaron utilizando células enteras de WT EcN y la serie de cepas modificadas descritas anteriormente. Las células se cultivaron e indujeron como se describe. Las células enteras de cada cepa inducida se resuspendieron a una DO600 de 0,5 y se hirvieron en tampón de carga de muestra de sulfato de dodecil litio 1x durante 15 min (Invitrogen, número de catálogo NP0007). Se cargó un volumen de 20 μL de cada muestra en gel SDS-PAGE de apilamiento de bis-tris al 4–12 % (Invitrogen, número de catálogo NP0322). Para los estándares, se incluyó iBright Prestained Protein Ladder (Invitrogen, número de catálogo LC5615) para estimar el tamaño de la proteína. Los geles se corrieron en MES SDS Buffer (Invitrogen, número de catálogo NP0002) a 200 V durante 30 min y se tiñeron con SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, número de catálogo LC6065) según las instrucciones del fabricante.

La biomasa activada se preparó a partir de tubos de cultivo de 10 ml como se describe en la sección anterior y luego se lisó para la determinación de los parámetros cinéticos. Para preparar el lisado, las muestras de biomasa descongeladas se diluyeron y sometieron a ultrasonidos usando un sonificador digital Branson con micropunta, luego se usó la fracción soluble de las muestras de lisado para el ensayo cinético. La proteína total en las muestras de lisado se midió mediante el ensayo de Bradford, y todas las muestras se normalizaron a una carga de proteína total de 10 µg por pocillo para el ensayo cinético. Las muestras de lisado se incubaron en glucosa M9 al 0,5 % con concentraciones de Phe que oscilaban entre 40 mM de Phe y 39 μM con diluciones dobles (también se incluyó tampón de ensayo sin Phe como control). El ensayo cinético se realizó en microplacas UV-star de 96 pocillos (Greiner) con TCA cuantificado mediante mediciones A290 cada minuto utilizando un lector de microplacas BioTek Synergy H1 ajustado a 37 °C de incubación estática. El ajuste del modelo de Michaelis-Menten se realizó mediante una regresión no lineal (función nls en R con fórmula V = (Vmax * [S])/(KM + [S])) para los datos de velocidad de tres réplicas por lotes. Los ajustes del modelo de ejemplo se pueden encontrar en la figura complementaria 7. La tasa V utilizada en la regresión no lineal se calculó a partir de la primera hora de actividad para cada concentración de Phe probada, donde la actividad permaneció lineal.

Todas las cepas se cultivaron en medios de fermentación, que se prepararon de la siguiente manera: extracto de levadura (40 g/L), K2HPO4 (5 g/L), KH2PO4 (3,5 g/L), (NH4)2HPO4 (3,5 g/L), MgSO4*7H2O (0,5 g/L), FeCl3 (1,6 mg/L), CoCl2*6H2O (0,2 mg/mL), CuCl2 (0,1 mg/L), ZnCl2 (0,2 mg/L), NaMoO4 (0,2 mg/L ), H3BO3 (0,05 mg/L), Glicerol (25 g/L), Antiespumante 204 (125 μL/L). La producción de cepas comenzó descongelando un vial de un banco de células y cultivando 1 ml del vial descongelado en 50 ml de medio de fermentación suplementado con diaminopimelato (300 µg/ml) en un matraz Ultra-Yield™ de 500 ml (Thomson Instrument Company). Las células se cultivaron con agitación a 375 rpm hasta que se alcanzó una DO600 de 10–15, momento en el que los cultivos se usaron para inocular 24,5 L de medio en un fermentador de un solo uso HyPerforma™ Thermo Scientific de 30 L con una DO600 inicial de 0,000016. El fermentador se controló a 37 °C, una concentración de oxígeno disuelto (OD) del 60 % y un pH de 7 usando hidróxido de amonio. Para SYNB1618, a una OD600 de 1,5, las células se activaron mediante la creación de un entorno con poco oxígeno (10 % de OD) y la adición de isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 1 mM). En este momento también se inició una alimentación de nutrientes (15 mL/Lh de 271,75 g/L de extracto de levadura, 86,27 g/L de glicerol) y se continuó hasta el final de la fermentación. Después de 3,5 h desde la adición de IPTG, la tasa de alimentación de nutrientes se duplicó a 30 mL/Lh. Para SYNB1934, a una DO600 de ~1,5, las células se activaron mediante la adición de IPTG (1 mM) y la DO se mantuvo al 30 %. También se inició una alimentación de nutrientes en este momento (11,25 mL/Lh de 271,75 g/L de extracto de levadura, 86,27 g/L de glucosa) y se continuó durante 3,5 h. Después de 3,5 h, la tasa de alimentación de nutrientes se duplicó a 22,5 mL/Lh durante un período de 2,75 h. Para ambas cepas, se añadió L-arabinosa a la fermentación (concentración final 10 mM) durante la última hora de fermentación. La cepa de control SYN094, que no contiene componentes de degradación de Phe, se cultivó en un biorreactor de 5 L en medios de fermentación que proporcionaban un contenido constante de OD del 30 % hasta alcanzar la fase estacionaria. Las cepas se recolectaron mediante filtración de flujo tangencial (TFF).

Al final de TFF, se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron hasta una concentración final de 150 OD600 en tampón lioprotector (trehalosa al 10 % p/vol, Tris 50 mM, pH 7,5). La suspensión celular formulada se usó para llenar viales de vidrio ámbar de 2 ml y se liofilizó hasta un contenido final de agua de <5 %. El material liofilizado se almacenó a 4 °C. El polvo liofilizado seco se reconstituyó con PBS (Quality Biological, 114-056-101) para igualar el volumen de preliofilización. Esta suspensión de células reconstituidas se usó para medir la actividad y la viabilidad.

Para determinar la viabilidad de las células bacterianas, las células resuspendidas se diluyeron y se tiñeron con tinción de ácido nucleico SYTOX Green (Life Technologies). Las células teñidas vivas y muertas se contaron directamente en un citómetro de imagen Nexcelom Bioscience Cellometer X2 según el protocolo del fabricante.

El modelo de simulación gástrica in vitro se diseñó para simular aspectos clave de la administración oral en humanos, incluida la concentración de oxígeno gástrico, la secreción de pepsina y el pH gástrico. El ensayo IVS se compone de incubaciones en placas de microtitulación de 96 pocillos diseñadas para simular las condiciones del estómago humano56. En resumen, las células liofilizadas se resuspendieron en PBS a temperatura ambiente. Las concentraciones de células bacterianas se determinaron mediante recuentos de células viables y/o totales. Se resuspendieron alícuotas de células en tampón de bicarbonato de sodio 0,077 M a 5,0 × 109 células por ml. Luego, esta solución se mezcló con partes iguales de fluido gástrico simulado56 que contenía Phe 20 mM, y se incubó durante 2 h a 37 °C con agitación en una cámara hipóxica in vitro de policarbonato (Coy Lab Products) calibrada con oxígeno al 2 %. La densidad de células SYNB1618 resultante en SGF fue de 2,5 × 109 células/ml. Para determinar la actividad de PAL, se recolectaron alícuotas de SGF periódicamente y se centrifugaron a 5000 × g durante 5 minutos usando una centrífuga de mesa, seguido de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) cuantificación de metabolitos, incluidos Phe y trans-cinamato ( PBS).

Los estudios de NHP se realizaron en Charles River Labs (Shrewsbury, MA) de conformidad con todas las secciones aplicables de las normas finales de la Ley de Bienestar Animal (Código de Regulaciones Federales, Título 9), la Política del Servicio de Salud Pública sobre Cuidado Humanitario y Uso de Animales de Laboratorio de la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio, y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. Se utilizaron doce monos cynomolgus macho de 2 a 5 años de edad (2,5 a 4 kg) y se mantuvieron con alimento para primates certificado internacionalmente (nutrición PMI, 5048). Los procedimientos operativos estándar relacionados con los estudios de NHP han sido revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Charles River Laboratories. Todos los animales de la cohorte gozaban de buena salud al comienzo del estudio y se lavaron durante al menos 7 días entre estudios. Se realizaron tres estudios de dosis única para comparar SYNB1934 con SYN1618. En cada uno de los días experimentales, seis sujetos NHP recibieron dosis de SYNB1618 o SYNB1934 y los datos presentados anteriormente son los resultados combinados de tres experimentos.

Los animales se mantuvieron en ayunas durante la noche del día anterior a la dosificación (Día 1) y durante los procedimientos del Día 1 sin exceder un máximo de 24 h. En la mañana del día 1, se extrajo una muestra de sangre de referencia de cada mono mediante venopunción. Los animales fueron inmovilizados temporalmente para la administración de dosis, pero no sedados. Las bacterias liofilizadas se resuspendieron y se administraron por vía oral en dosis de 1011 células vivas a cada animal, junto con 5 mL de bicarbonato de sodio 0,36 M, 7,7 mL de 20 mg/mL de l-fenil-D5-alanina (C/D/N Isotopes Inc.) , y 6,1 ml de digerido péptico de peptona de 500 g/l (Sigma). Se recogieron plasma y orina acumulada para su posterior análisis. Después de la dosificación, los animales se devolvieron a sus jaulas y se colocó una bandeja de recogida de orina limpia en el fondo de cada jaula. En total, 6 h después de la dosificación inicial, se midió y registró el volumen acumulado de orina, y las muestras de orina se almacenaron a -80 °C. Se recogieron muestras de sangre a las 0,5, 1, 2, 4 y 6 h después de la dosis, y el plasma se preparó y congeló a -80 °C. Las concentraciones de metabolitos se cuantificaron utilizando un ensayo de derivatización con detección LC-MS/MS.

La cuantificación de TCA, d5-TCA, HA y d5-HA se realizó utilizando el modo de monitoreo de reacción múltiple (MRM) en un sistema Thermo TSQ Quantum Max de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) de triple cuadrupolo. Los estándares utilizados fueron ácido trans-cinámico (Acros, 158570050), ácido trans-cinámico-d5 (CDN Isotopes, D-5284), ácido hipúrico (Sigma, 112003) y ácido hipúrico-d5 (CDN Isotopes, D-5588) .

Los estándares se prepararon en agua con las siguientes concentraciones: 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20, 100 y 250 μg/mL. Las muestras se almacenaron a –80 °C antes del análisis. Las muestras de orina se diluyeron 40 veces en agua antes del procesamiento de la muestra. Se añadió creatinina (Sigma, 60275) a la mezcla estándar al analizar HA urinario y d5-HA (0,32, 1,6, 8, 40, 200, 1000 y 2500 μg/mL). En una placa de 96 pocillos, se transfirieron 10 µL de los estándares y las muestras, seguido de la adición de 90 µL de solución de derivatización (50 mM de 2-hidrazinoquinolina, disulfuro de dipiridilo y trifenilfosfina en acetonitrilo con 1 µg/mL de solución interna marcada isotópicamente). estándar 13C9-15N-Phe (Cambridge Isotopes, CNLM-575-H-PK) y d5-creatinina (CDN Isotopes, D-7707).La placa se termoselló con una lámina ThermASeal, se mezcló y se incubó a 60 °C. durante 1 h para derivatizar las muestras. Las muestras derivatizadas se centrifugaron a 3200 × g durante 5 m. A otra placa, se transfirieron 20 µL de las muestras derivatizadas y se diluyeron con 180 µL de ácido fórmico al 0,1 % en agua/acetonitrilo ( 140:40). El volumen de inyección utilizado fue de 10 µL y el tiempo de ejecución fue de 4,25 m a un caudal de 0,5 mL/minuto. La fase móvil A fue ácido fórmico al 0,1 % en el agua y la fase móvil B fue ácido fórmico al 0,1 % ácido en acetonitrilo/isopropanol (90:10).La separación cromatográfica se realizó utilizando una columna Phenomenex C18 (3 µm, 100 × 2 mm) con el siguiente gradiente: 10% B de 0 a 0,5 m, 10 a 97% B de 0,5 a 2 m, 97% B de 2 a 4 m, y 10% B de 4 a 4,25 m. Se utilizó la monitorización de reacciones múltiples en modo positivo para el análisis de espectrometría de masas en tándem. Se monitorearon las siguientes transiciones de masa para la cuantificación: TCA (290/131), d5-TCA (295/136), HA (321/160), d5-HA (326/160) y creatinina (114/44).

Las medias de los grupos, los errores/desviaciones estándar y las regresiones lineales se calcularon en Microsoft Excel. Para calcular los valores de p, se realizaron pruebas t de Student no apareadas, ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparación múltiple de Tukey, o ANOVA de Welch con pruebas de comparación múltiple T3 de Dunnett en Graphpad Prism o en Excel. Las áreas bajo la curva se calcularon con el método trapezoidal lineal utilizando Graphpad Prism y las líneas de base se establecieron mediante los valores promedio en el tiempo 0 para cada experimento aplicable.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y los archivos de información complementaria que lo acompañan). Los datos de citometría de flujo (Fig. 1b) se proporcionan como archivos .fcs en la carpeta comprimida "Fig1b_fcs_files" en los datos de origen. Todos los demás datos se proporcionan en el archivo "Source data.xlsx". La cepa 1917 de E. coli Nissle se obtuvo de DSMZ y se usó para la construcción de cepas diseñadas que condujeron a la generación de SYNB1618 y SYNB1934. Todas las cepas descritas en este manuscrito se derivaron del mismo origen parental. Las cepas modificadas descritas en este manuscrito pueden estar disponibles sujetas a un MTA, que puede solicitarse poniéndose en contacto con los autores correspondientes. La secuencia completa del genoma de SYNB1618 está disponible con el ID de BioProject: PRJNA482064 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA482064). La secuencia completa del genoma de SYNB1934 está disponible con el ID de BioProject: PRJNA749270 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA749270). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

de Groot, MJ, Hoeksma, M., Blau, N., Reijngoud, DJ & van Spronsen, FJ Patogénesis de la disfunción cognitiva en la fenilcetonuria: revisión de hipótesis. lunar. Gineta. metab. 99, S86–S89 (2010).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Daelman, L., Sedel, F. & Tourbah, A. Manifestaciones neuropsiquiátricas progresivas de fenilcetonuria en la edad adulta. Rev. Neurol. (París). 170, 280–287 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bilder, DA et al. Revisión sistemática y metanálisis de síntomas neuropsiquiátricos y funcionamiento ejecutivo en adultos con fenilcetonuria. desarrollo Neuropsicología. 41, 245–260 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Longo, N. et al. Seguridad y eficacia a largo plazo de la sapropterina: la experiencia del registro de PKUDOS. mol. Gineta. metab. 114, 557–563 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Longo, N. et al. Progresión del desarrollo a largo plazo en bebés y niños pequeños que toman sapropterina para la fenilcetonuria: un análisis de dos años de seguridad y eficacia. Gineta. Medicina. 17, 365–373 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Somaraju, UR & Merrin, M. Dihidrocloruro de sapropterina para la fenilcetonuria. Sistema de base de datos Cochrane. Rev. CD008005 (2010) https://doi.org/10.1002/14651858.CD008005.pub4.

Bell, SM et al. Formulación y optimización de la PEGilación de la fenilalanina amoniaco liasa terapéutica PEGilada para el tratamiento de la fenilcetonuria. PLoS One 12, e0173269 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Sarkissian, CN et al. Evaluación preclínica de múltiples especies de fenilalanina amonio liasa recombinante PEGilada para el tratamiento de la fenilcetonuria. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 105, 20894–20899 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Charbonneau, MR, Isabella, VM, Li, N. & Kurtz, CB Desarrollo de una nueva clase de terapias bacterianas vivas diseñadas para tratar enfermedades humanas. Nat. común 11, 1–11 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Isabella, VM et al. Desarrollo de un agente terapéutico bacteriano vivo sintético para la enfermedad metabólica humana fenilcetonuria. Nat. Biotecnología. 36, 857–864 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Williams, JS, Thomas, M. & Clarke, DJ El gen stlA codifica una fenilalanina amoniaco-liasa que participa en la producción de un antibiótico estilbeno en Photorhabdus luminescens TT01. Microbiología 151, 2543–2550 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hoskins, JA La aparición, el metabolismo y la toxicidad del ácido cinámico y compuestos relacionados. Aplicación J. Toxicol. 4, 283–292 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hoskins, JA & Gray, J. Fenilalanina amoníaco liasa en el tratamiento de la fenilcetonuria: la relación entre el cinamato ingerido y el hipurato urinario en humanos. Res. común química Patol. Farmacol. 35, 275–282 (1982).

CAS PubMed Google Académico

van Spronsen, FJ y otros Fenilcetonuria. Húmedo. Rdo. Dis. Remilgado. 7, 1–19 (2021).

Google Académico

Puurunen, Marja K, et al. Seguridad y farmacodinámica de un E. coli Nissle diseñado para el tratamiento de la fenilcetonuria: un primer estudio de fase 1/2a en humanos. Nat. metab. 3, 1125–1132 (2021).

Rogers, JK, Taylor, ND & Church, GM Ingeniería de vías biosintéticas basada en biosensores. actual Opinión Biotecnología. 42, 84–91 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, G. & Withers, SG Detección basada en FACS de ultra alto rendimiento para la evolución de enzimas dirigidas. ChemBioChem 10, 2704–2715 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Flachbart, LK, Sokolowsky, S. y Marienhagen, J. Desplazados por engañadores: la prevención de la diafonía de biosensores es fundamental para el éxito de las campañas de detección de alto rendimiento basadas en biosensores. Sintetizador ACS. Biol. 8, 1847–1857 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siedler, S. et al. Desarrollo de un biosensor bacteriano para la detección rápida de la producción de ácido p-cumárico en levaduras. Sintetizador ACS. Biol. 6, 1860–1869 (2017).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Raman, S., Rogers, JK, Taylor, ND & Church, GM Optimización guiada por evolución de vías biosintéticas. PNAS 111, 17803–17808 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Binder, S. et al. Un enfoque de alto rendimiento para identificar variantes genómicas de productores de metabolitos bacterianos a nivel de una sola célula. Genoma Biol. 13, R40 (2012).

Liu, Y. et al. Evolución basada en biosensores y elucidación de una ruta biosintética en Escherichia coli. Sintetizador ACS. Biol. 6, 837–848 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Armetta, J. et al. Enfoque de ingeniería enzimática basada en biosensores aplicado a la biosíntesis de psicosas. sintetizador Biol. 4, 1–10 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Taylor, ND et al. Ingeniería de un factor de transcripción alostérico para responder a nuevos ligandos. Nat. Métodos 13, 177–183 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Snoek, T. et al. Ingeniería guiada por evolución de biosensores de molécula pequeña. Ácidos Nucleicos Res. 48, 1–14 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Machado, LFM, Currin, A. & Dixon, N. Evolución dirigida del factor de transcripción alostérico PcaV para generar un biosensor para aldehídos aromáticos. J. Biol. Ing. 13, 1–15 (2019).

Artículo CAS Google Académico

MacDonald, MJ & D'Cunha, GB Una visión moderna de la fenilalanina amoniaco liasa. Bioquímica Biol celular. 85, 273–282 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wagner, JM y col. Un análisis comparativo de FACS basados ​​en gotas y de células individuales para mejorar los fenotipos de producción: sobreproducción de riboflavina en Yarrowia lipolytica. metab. Ing. 47, 346–356 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Meyer, A. et al. Optimización de un biocatalizador de células enteras mediante el empleo de sensores de productos codificados genéticamente dentro de reactores de nanolitros. Nat. química 7, 673–678 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Weng, L. & Spoonamore, JE Detección de alto rendimiento habilitada por microfluidos de gotas para la ingeniería de proteínas. Micromáquinas 10, 734 (2019).

Artículo PubMed Central Google Académico

Dunn, MR et al. Sistemas de sensores. Patente PCT/US2019/018273 (2019).

Canción, Y. et al. Modelado comparativo de alta resolución con RosettaCM. Estructura 21, 1735-1742 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Altschul, SF et al. Gapped BLAST y PSI-BLAST: una nueva generación de programas de búsqueda de bases de datos de proteínas. Ácidos Nucleicos Res. 25, 3389-3402 (1997).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kamisetty, H., Ovchinnikov, S. & Baker, D. Evaluación de la utilidad de las predicciones de contacto de residuos a residuos basadas en la coevolución en una era rica en secuencias y estructuras. PNAS 110, 15674–15679 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caldwell, J., Moffatt, JR & Smith, RL Supervivencia post-mortem de la formación de ácido hipúrico en muestras de tejido de cadáver humano y de rata. Xenobiotica 6, 275–280 (1976).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lees, HJ, Swann, JR, Wilson, ID, Nicholson, JK y Holmes, E. Hippurate: la historia natural de un cometabolito microbiano de mamíferos. J. Proteoma Res. 12, 1527-1546 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sonnenborn, U. Escherichia coli cepa Nissle 1917: desde el banco hasta la cama y de regreso: historia de una cepa especial de Escherichia coli con propiedades probióticas. FEMS Microbiol. Letón. 363, 1–6 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Schultz, M. Uso clínico de E. coli Nissle 1917 en la enfermedad inflamatoria intestinal. inflamacion enfermedad intestinal 14, 1012–1018 (2008).

Artículo PubMed Google Académico

Guo, S. et al. Escherichia coli Nissle 1917 protege la función de barrera intestinal al inhibir la activación mediada por NF-κB de la vía de señalización MLCK-P-MLC. Mediadores Inflamación. 2019, 5796491 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Kurtz, C. et al. Desarrollo traslacional de terapias basadas en microbiomas: cinética de E. coli Nissle y cepas modificadas en humanos y primates no humanos. clin. Traducir ciencia 11, 200–207 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sato, T., Kiuchi, F. y Sankawa, U. Inhibición de la fenilalanina amoniaco-liasa por derivados del ácido cinámico y compuestos relacionados. Fitoquímica 21, 845–850 (1982).

Artículo CAS Google Académico

Appert, C., Logemann, E., Hahlbrock, K., Schmid, J. & Amrhein, N. Propiedades estructurales y catalíticas de las cuatro isoenzimas de fenilalanina amoniaco liasa del perejil (Petroselinum crispum Nym.). EUR. J. Bioquímica. 225, 491–499 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Camm, EL & Towers, GHN Fenilalanina amoníaco liasa. Fitoquímica 12, 961–973 (1973).

Artículo CAS Google Académico

Pridham, JB & Woodhead, S. Formas multimoleculares de fenilalanina-amoníaco liasa en Alternaria. Bioquímica Soc. Trans. 2, 1070–1072 (1974).

Artículo CAS Google Académico

Charbonneau, MR et al. Desarrollo de un modelo mecanístico para predecir la actividad biótica sintética en voluntarios sanos y pacientes con fenilcetonuria. común Biol. 4, 1–12 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Lim, H.-W., Park, S.-S. y Lim, C.-J. Purificación y propiedades de la fenilalanina amoniaco-liasa de la hoja de mostaza. mol. Celdas 7, 715–720 (1997).

CAS PubMed Google Académico

Sirin, S., Aydas, SB & Aslim, B. Evaluación bioquímica de la fenilalanina amoníaco liasa de la planta endémica Cyathobasis fruticulosa (Bunge) Aellen. para el tratamiento dietético de la fenilcetonuria. Tecnología de los alimentos. Biotecnología. 54, 296–303 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Moffitt, MC et al. Descubrimiento de dos liasas de fenilalanina amoniaco de cianobacterias: caracterización cinética y estructural. Bioquímica 46, 1004–1012 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wilks, JC & Slonczewski, JL pH del citoplasma y periplasma de Escherichia coli: medición rápida por fluorimetría de proteína fluorescente verde. J. Bacteriol. 189, 5601–5607 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt-Dannert, C. & Arnold, FH Evolución dirigida de enzimas industriales. Tendencias Biotecnología. 17, 135–136 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sawitzke, JA et al. Recombinación: ingeniería genética in vivo en E. coli, S. enterica y más allá. Métodos Enzymol. 421, 171–199 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Remmert, M., Biegert, A., Hauser, A. & Söding, J. HHblits: búsqueda de secuencias de proteínas iterativas ultrarrápidas por alineación HMM-HMM. Nat. Métodos 9, 173–175 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Fleishman, SJ et al. RosettaScripts: una interfaz de lenguaje de secuencias de comandos para la suite de modelado macromolecular de Rosetta. PLoS One 6, 26523 (2011).

Parque, H. et al. Optimización simultánea de funciones de energía biomolecular en características de moléculas pequeñas y macromoléculas. J. Chem. Cálculo de la teoría. 12, 6201–6212 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stemmer, WPC & Morris, SK PCR inversa enzimática: un método de fragmento único independiente del sitio de restricción para mutagénesis dirigida al sitio de alta eficiencia. Biotécnicas 13, 215–220 (1992).

Google Académico

Minekus, M. et al. Un método estandarizado de digestión in vitro estático adecuado para alimentos: un consenso internacional. Función de alimentos. 5, 1113–1124 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Henikoff, S. & Henikoff, JG Matrices de sustitución de aminoácidos de bloques de proteínas. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 89, 10915–10919 (1992).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Talevich, E., Invergo, BM, Cock, PJA & Chapman, BA Bio.Phylo: un conjunto de herramientas unificado para procesar, analizar y visualizar árboles filogenéticos en Biopython. BMC Bioinformática 13, 209 (2012).

Gallo, PJA et al. Biopython: herramientas de Python disponibles gratuitamente para biología molecular computacional y bioinformática. Bioinformática 25, 1422–1423 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Los autores agradecen a Caitlin Allen, Mark Charbonneau, Caroline Kurtz y Dave Hava por sus comentarios a lo largo de este proyecto y durante la preparación de este manuscrito.

por jr. El viaje

Dirección actual: Novo Nordisk Research Center Seattle Inc, 530 Fairview Ave N, Seattle, WA, 98109, EE. UU.

Lindong Weng

Dirección actual: Sana Biotechnology, 1 Tower Place Suite 500, South San Francisco, CA, 94080, EE. UU.

Zymergen Inc. (anteriormente enEvolv Inc.), 100 Acorn Park Drive, Cambridge, MA, 02140, EE. UU.

Kristin J. Adolfsen, Isolde Callihan, Per Jr. Greisen, James Spoonamore, Lauren E. Fitch, Lindong Weng, Carl J. Weile, Jay H. Konieczka y Adam G. Lawrence

Synlogic Inc, 301 Binney St, Cambridge, MA, 02139, EE. UU.

Catherine E. Monahan, Munira Momin, Mary Joan Castillo, Lauren Renaud, Teodelinda Mirabella, Andres Abin-Fuentes & Vincent M. Isabella

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KJA, AGL, VMI y AA supervisaron el proyecto. KJA, IC, VMI y AA analizaron los datos. JS llevó a cabo el descubrimiento de sensores. PG supervisó la ingeniería de enzimas y proporcionó todas las recomendaciones de diseño de PAL. LEF diseñó computacionalmente los cebadores necesarios para introducir las mutaciones, y la biblioteca PAL combinatoria fue construida por KJA. KJA, LW e IC realizaron pruebas de detección basadas en sensores. KJA, IC y CWLEF realizaron ensayos de biomasa activada basados ​​en placas y la secuenciación de variantes. realizó la generación de figuras PyMOL. AGL, PG, JS y JHK supervisaron. CM fue responsable de la construcción de cepas candidatas y el rendimiento/análisis de experimentos in vitro. AA y MM se encargaron de la fermentación y formulación de las cepas. MJC realizó y analizó el análisis de espectroscopia de masas. TM y LR supervisó la realización de estudios NHP.

Correspondencia a Vincent M. Isabella.

Los autores declaran los siguientes intereses contrapuestos: todos los autores tienen acciones en Synlogic, Inc. o Zymergen, Inc. y pueden ganar o perder económicamente a través de la publicación.

Información de revisión por pares Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Adolfsen, KJ, Callihan, I., Monahan, CE et al. Mejora de un agente terapéutico bacteriano vivo sintético para la fenilcetonuria con ingeniería enzimática habilitada por biosensor. Nat Comun 12, 6215 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-26524-0

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Recibido: 14 junio 2021

Aceptado: 12 de octubre de 2021

Publicado: 28 de octubre de 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-26524-0

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